Pengujian Kadar Histamin Secara Spectrofluorometri

Metode pengujian kadar Histamin ini Dapat diterapkan pada jenis-jenis ikan yang tergolong dalam Scromboidea, yang terdapat dalam ikan-ikan Tuna, Bonito, Kingfish, dan Mackerel serta ikan Mahi-mahi (dolphin)

Prinsip : Histamin diekstrak dari jaringan daging contoh menggunakan methanol dan sekaligus mengkonversi histamine ke dalam bentuk OH.  Zat – zat histamine selanjutnya dimurnikan melalui resin penukar ion dan diubah ke bentuk derivatnya dengan senyawa OPT.  Besarnya fluorosensi histamine diukur secra flurometri pada panjang gelombang eksitasi 350 nm dan emisi 444 nm

Peralatan :

a.         Corong dan botol filtrate contoh;

b.         Homogenizer (blender);

c.          Kertas saring kasar, plastic, karet pengikat;

d.         Kolom resin 20 cm X 0,8 cm, reservoir 2 cm X 5 cm;

e.         Labu Takar 25 ml, 50 ml, 100 ml dan 1.000 ml;

f.           Pipet volumetric;

g.         Spektroflurometer;

h.         Stirer-plate;

i.           Tabung reaksi 50 ml bertutup;

j.           Timbangan analitis;

k.         Waterbath.

 

Alat Spectrolorometri, Perkin Elemer LS 45

Kolom untuk tahap elusi

Pereaksi :

a.    Metanol;

b.    Aquades;

c.     Glasswool;

d.    NaOH 1 N: Larutkan 4 g NaOH dalam 100 ml Aquades

e.    HCl 0,1 N: Encerkan 8 ml HCl 12,5 N (37 %) dalam 1.000 ml Aquades

f.   Orto-ptalatdikarboksildehid (OPT) 0,1 % : Larutkan 0,1 g OPT dalam 100 ml methanol, larutan ini disiapkan pada kondisi segar dalam setiap analisa

g.  Asam Phosphat (H₃PO₄) 3,57 N: Encerkan 121,8 ml H₃PO₄ (85%) menjadi 1.000 ml aquades, standarkan larutan ini dengan mengambil 5 ml dan titrasi dengan NaOH 1 N dengan indicator fenolftalin)

h.    Resin penukar ion jenis Dowex 1 – X8 50 – 100 mesh

i.      Pembuatan larutan standar histamine

·         Larutan stok 1 mg/ml (1.000 ppm)

  Timbang teliti 169,1 mg Histamin 2 HCl, larutkan dan tepatkan menggunakan HCl 0,1 N dalam labu takar 100 ml sampai batas volume.  Siapkan larutan ini dalam kondisi segar setiap minggu dan disimpan dalam refrigerator

·           Larutan stock 10 µl/ml (10 ppm)

   Pipet 1 ml larutkan stock (1.000 ppm) masukkan ke dalam labu takar 100 ml dan  tambahkan larutan HCl 0,1 sampai batas volume.  Siapkan larutan ini dalam kondisi segar setiap minggu dan disimpan dalam refrigerator

j.      Larutan kerja

Buat larutan kerja 0,1 µg/ml (0,1 ppm); 0,2 µg/ml (0,2 ppm); 0,3 µg/ml (0,3 ppm).

Siapkan larutan kerja ini setiap hari (setiap akan digunakan).  Apabila larutan kerja tersebut menghasilkan fluorosensinya yang maksimal pada pembacaan dengan instrument, maka larutan kerja tersebut dapat diencerkan sesuai dengan keperluan

Prosedur Analisis:

1. Preparasi contoh

a.  Blender contoh hingga homogen

b. Timbang seksama lebih kurang 10 g contoh dalam beaker glass 250 ml dan tambahkan 50 ml methanol, blender hingga homogen

c. Panaskan diatas waterbath selama 15 menit pada suhu 60 ^oC dijaga sample dalam kondisi tertutup, dinginkan hingga suhu kamar

d. Tuangkan contoh ke dalam labi takar 100 ml dan tepatkan hingga volume labu dengan methanol

e. Saring menggunakan kertas saring dan filtratnya ditampung dalam botol contoh. Pada tahap ini filtrate contoh dapat disimpan dalam refrigerator

2. Persiapan Resin

a)   Timbang 3 gram resin untuk setiap kolom dalam beaker glass 250 ml

b)  Tambahkan 15 ml NaOH 2 N/g resin untuk mengubah resin menjadi bentuk OH

c)   Aduk menggunkan stirrer- plate selama 30 menit

d)  Tuang cairan pada bagian atas dan ulangi penambahan NaOH 2 N dengan jumlah yang sama

e)   Cuci/bilas resin dengan aquades sebanyak 3 kali

f)    Saring melalui kertas saring No. 588 atau yang setara dan cuci kembali aquades

g)   Siapkan resin setiap minggu dan simpan dalam aquades

3. Persiapan Kolom Resin

a)   Masukkan glasswool ke dalam kolom resin setinggi ± 1,5 cm

b)  Masukkan resin dalam medium air ke kolom resin setinggi ± 8 cm, pertahankan volume air yang berada di atas resin ± 1 cm, jangan dibiarkan kering.

c)   Letakkan labu takar 50 ml yang sudah berisi 5 ml HCl 1 N di bawah kolom resin guna menampung elusi contoh yang dilewatkan pada kolom resin.  Diperlihatkan dalam gambar di bawah ini

4. Pemurnian Contoh

a)   Pipet 1 ml Filtrat contoh, masukkan dalam kolom resin, kran kolom resin dalam posisi terbuka biarkan aliran menetes (hasil elusi) ditampung dalam labu takar 50 ml

b)  Tambahkan aquades pada saat tinggi cairan ± 1 cm di atas resin dan biarkan cairan terelusi. Lakukan seterusnya hingga hasil elusi dalam labu takar tepat 50 ml.  Hasil elusi (contoh) dapat disimpan dalam refrigerator.

5. Pembentukan Senyawa Turunan (derivatisasi)

Siapkan tabung reaksi 50 ml masing-masing untuk contoh, standard an blanko

a)       Pipet masing-masing 5 ml filtrate contoh, larutan standar kerja dan blanko (HCl 0.1 N)

b)       Tambahkan ke dalam tabung reaksi di atas berturut-turut;

·   10 ml HCl 0,1 N kocok

·  3 ml NaOH 1 N, kocok, dalam waktu 5 menit harus sudah ditambah 1 ml OPT 0,1%, kocok dan biarkan selama $ menit

·   3 ml H₃PO₄ 3,57 N kocok

c)        Lakukan pengukuran fluorosence terhadap contoh, standar dan blanko sesegera mungkin dengan alat spectrofluorometer pada panjang gelombang exsitasi: 350 nm dan emisi: 444 nm dalam jangka waktu 90 menit.

Perhitungan

1. Masukkan harga konsentrasi dan fluoresensi dari larutan standar kerja ke dalam program linier kalkulator.  Nilai: koefisien regresi ( R ), slope (b) dari intersep (a) digunakan untuk menghitung konsentrasi contoh.  Masukkan harga fluoresence contoh ke persamaan regresi standar:
   

1. 2.  Setelah didapat harga x , kalikan dengan faktor pengenceran dan kembalikan ke berat contoh. Nyatakan kandungan histamin dalam  (µg/g) atau mg / kg contoh.

Pelaporan

a. Jika angka desimal kurang dari 5 (lima) maka pembulatan ke bawah, tetapi bila lebih dari 5 (lima) pembulatan ke atas.Contoh :

     14,454 dibulatkan menjadi 14,76

     14,466 dibulatkan menjadi 14,47

b. Jika angka ke tiga di belakang koma 5 (lima), dan angka kedua genap, maka angka lima tersebut menjadi hilang tapi bila angka kedua ganjil maka pembulatan ke atas. Contoh :

     14,765 dibulatkan menjadi 14,76

     14,475 dibulatkan menjadi 14,48

Keamanan dan Keselamatan Kerja

Untuk menjaga keamanan dan keselamatan kerja selama melakukan analisa maka perlu diperhatikan hal-hal sebagai berikut :

a.              Cuci tangan sebelum dan sesudah melakukan analisa.

b.             Gunakan jas laboratorium selama bekerja.

Acuan : SNI – 01 – 2354.10 : 2009

Pengujian Kadar Protein Total

Metode oengujian kadar protein total ini diterapkan terhadap hasil perikanan termasuk ikan, udang dan kerang-kerangan serta hasil samping perikanan.

Prinsip: Senyawa nitrogen dilepaskan dari jaringan daging melalui destruksi menggunakan asam sulfat pekat dengan batuan panas pada suhu 410^oC selama 2 jam (sampai diperoleh larutan jernih ) dimana senyawa nitrogen terikat pleh sulfat membentuk ammonium sulfat. Selanjutnya ammonium sulfat diubah menjadi garam basa NH4OH dengan penambahan NaOH. NH4OH distilasi menggunakan panas uap untuk memisahkan senyawa amoniak. Amoniak ditangkap pleh asam borat membentuk ammonium borat dan selanjutnya dilakukan titrasidengan asam klorida. Penetapan jumlah nitrogen dihitung secara stokiometri dan kadar protein diperoleh dengan mengkalikan nitrogen dengan faktor konversi.

Peralatan   

a.    Timbangan analitis kepekatan 0,0001 g

b.    Alat destruksi kjedahl  ukuran 250 ml

c.     Alat destilasi uap

d.    Peralatan gelas

e.    Saringan No 20

Pereaksi

a.    Tablet katalis

b.    Kertas timbang bebas N

c.     Batu didih

d.    Larutan asam borat 4 %

e.    Larutan 4 g H₃BO₃ dalam air tambahkan 0,7 ml larutan indikator methyl red  0,1 %

f.      Asam sulfat pekat

g.    Hidrogen peroksida (H₂O₂ ) 30-35 %

h.    Larutan natrium hidroksida – natrium thiosulfat

i.      Larutan standar asam klorida  ± 0,2 N

Preparasi Contoh

·      Tepung Ikan

Lumatkan contoh dengan blender dan sejenisnya hingga partikel dapat melewati saringan 20 mesh. Masukkan contoh dalam wadah plastik atau gelas yang bersih dan bertutup.

·      Produk perikanan selain tepung ikan

Lumatkan contoh hingga homogen dan masukkan dalam wadah plastik atau gelas yang bersih dan bertutup. Jika contoh tidak langsung diuji, simpan contoh dalam refrigerator atau freezer sampai saatnya untuk dianalisa. Kondisikan contoh pada suhu ruang dan pastikan contoh masih tetep homogen sebelum ditimbang. Jika terjadi pemisahan antara cairan dan contoh maka perlu diaduk ulang dengan blender sebelum dilakukan analisa.

Prosedur  :

a.  Timbang seksama kira-kira 2 g homogenat contoh pada kertas timbang, lipat-lipat dan masukkan ke dalam labu destruksi.

b.    Tambahkan 2 buah tablet katalis serta beberapa butir batu didih.

c.  Tambahkan 15 ml H₂SO₄ pekat ( 95-97 %) dan 3 ml H₂O₂ secara perlahan-lahan dan diamkan 10 menit dalam ruang asam.

d.  Destruksi pada suhu 410^o C selama ± 2 jam atau sampai larutan jernih, diamkan hingga mencapai suhu kamar dan tambahkan 50 – 75 ml aquades.

e.  Siapkan erlemeyer berisi 25 ml larutan H₃BO₃ 4 % yang mengandung indikator sebagai penampung destilat.

f.      Pasang labu yang berisi hasil destruksi pada rangkaian alat destilasi uap

g.    Tambahkan 50-75 ml Larutan natrium hidroksida-thiosulfat

h.    Lakukan destilasi dan tampung destilat dalam erlemeyer tersebut hingga volume mencapai minimal 150 ml ( hasil destilat akan berubah menjadi kuning )

i.      Titrasi hasil destilat dengan HCL ± 0,2 N yang sudah dibakukan sampai warna berubah dari kuning menjadi pink

j.      Lakukan pengerjaan blanko seperti tahapan contoh

k.    Lakukan pengujian contoh minimal duplo (dua kali)

Pelaporan

a.    Jika hasil perhitungan diperoleh angka desimal kurang dari 5 (lima) maka pembulatan turun, tetapi jika lebih dari 5 (lima) pembulatan naik.

b.    Jika perhitungan diperoleh angka desimal 5 (lima) yang akan dibulatkan dari angka genap yang ada di depannya, maka angka lima tersebut menjadi hilang, tetapi jika angka di depannya ganjil maka pembulatan akan naik.

Keamanan dan Keselamatan Kerja ( K3)

Untuk menjaga keamanan dan keselamatan kerja selama melakukan analisis penentuan kadar protein perlu diperhatikan hal-hal sebagai berikut:

a.    Cuci tangan sebelum dan sesudah melakukan analisa

b.    Gunakan jas Lab selama bekerja di laboratorium

c.     Tempatkan unit alat destruksi dalam lemari asam

d.  Saat menambahkan asam sulfat kedalam labu destruksi dilakukan pada lemari asam gunakan masker serta dispenser

e.    Saat melakukan destruksi pastikan air pendingin dan blower dapat digunakan selama proses berlangsung

Acuan :  SNI – 01 – 2354.4 – 2006

Pengujian Kadar Lemak Total

Prinsip Pengujian Kadar Lemak Total adalah Lemak dalam contoh diekstraksi dengan diethyl eter. Contoh diekstraksi dengan pelarut organik untuk mengeluarkan lemak dari contoh dengan bantuan pemanasan pada suhu titik didih pelarut. Pelarut organik yang mengikat lemak selanjutnya dipisahkan dengan penguapan (evaporasi), sehingga hasil lemak tertinggal dalam labu. Penetapan berat lemak dihitung secara gravimetri. Adapun ruang lingkup metode ini untuk menghitung kadar lemak total pada produk perikanan.

Peralatan

Pemanas listrik, penyangga, kondesor dan ekstraktor soxhlet

Selongsong lemak

Desikator

Oven suhu

Kertas saring

Pereaksi: Diethyl ether atau chloroform

Preparasi contoh

** Tepung Ikan** Lumatkan contoh dengan blender dan sejenisnya hingga partikel dapat melewati saringan 20 mesh. Masukkan contoh dalam wadah plastik atau gelas yang bersih dan bertutup.

** Produk perikanan selain tepung ikan **

1. Lumatkan contoh hingga homogen dan masukkan dalam wadah plastik atau gelas yang bersih dan bertutup. Jika contoh tidak langsung diuji, simpan contoh dalam refrigerator atau freezer sampai saatnya untuk dianalisa. 
2. Kondisikan contoh pada suhu ruang dan pastikan contoh masih tetep homogen sebelum ditimbang. Jika terjadi pemisahan antara cairan dan contoh maka perlu diaduk ulang dengan blender sebelum dilakukan analisa

Prosedur  :

1. Homogenkan contoh, potong kecil-kecil lalu ditumbuk dengan mortar (dilumatkan).
2. Timbang contoh ± 2 – 3 gram dengan menggunakan kertas saring, catat beratnya (A).      Bungkus contoh sedemikian hingga bisa masuk ke selongsong lemak.
3. Panaskan labu ekstraksi pada oven dengan suhu 100 ^OC ± 60 menit lalu dinginkan dan timbang beratnya (sampai beratnya konstan), catat beratnya (B).
4. Masukkan selongsong lemak pada soxhlet, pasang labu ekstraksi pada soxhletnya.
5. Agar proses ekstraksi berjalan sempurna, maka perhatikan dengan benar bahwa air pendingin pada kondensor sudah mengalir dengan baik.
6.  Isi labu ekstraksi ± 50 ml dietyl eter (± 1,5 putaran soxhlet).
7. Panaskan labu, sehingga dietyl eter akan menguap, uap tersebut akan didinginkan oleh   kondensor sehingga akan terbentuk tetesan-tetesan dietyl eter yang nantinya merendam contoh pada selongsong.
8. etelah soxhlet penuh, maka pelarutnya akan turun bersama-sama dengan lemak yang didapat dari hasil ekstraksi.
9. Biarkan proses ini berlangsung ± 16 jam, dengan tetap memperhatikan perubahan volume yang terjadi pada dietyl eter selama pemanasan (kemungkinan menguap).
10.  Setelah selesai, pisahkan pelarut dengan lemaknya dengan cara dipanaskan pada suhu 100^OC selama 60 menit (sampai berat konstan).  Dinginkan lalu timbang, catat beratnya   ( C ).

Pelaporan

a. Jika hasil perhitungan diperoleh angka desimal kurang dari 5 (lima) maka pembulatan turun, tetapi jika lebih dari 5 (lima) pembulatan naik.

b. Jika perhitungan diperoleh angka desimal 5 (lima) yang akan dibulatkan dari angka genap yang ada didepannya, maka angka lima tersebut menjadi hilang, tetapi jika angka didepannya ganjil maka pembulatan akan naik.

Keamanan dan Keselamatan Kerja ( K3)

• Untuk menjaga keamanan dan keselamatan kerja selama melakukan analisis penentuan kadar protein perlu diperhatikan hal-hal sebagai berikut: 
• Cuci tangan sebelum dan sesudah melakukan analisa 
• Gunakan jas Lab selama bekerja di laboratorium 
• Saat membuang diethyl eter atau chloroform gunakan masker 
• Apabila menggunakan diethyl eter, pastikan tidak ada nyala api atau asap rokok di sekitar ruangan 
• Saat melakukan ekstraksi pastikan air pendingin dan blower dapat digunakan selama proses berlangsung 

Acuan :SNI – 01 – 2354.3  – 2006

v