Pengujian Kadar Histamin Secara Spectrofluorometri

Metode pengujian kadar Histamin ini Dapat diterapkan pada jenis-jenis ikan yang tergolong dalam Scromboidea, yang terdapat dalam ikan-ikan Tuna, Bonito, Kingfish, dan Mackerel serta ikan Mahi-mahi (dolphin)

Prinsip : Histamin diekstrak dari jaringan daging contoh menggunakan methanol dan sekaligus mengkonversi histamine ke dalam bentuk OH.  Zat – zat histamine selanjutnya dimurnikan melalui resin penukar ion dan diubah ke bentuk derivatnya dengan senyawa OPT.  Besarnya fluorosensi histamine diukur secra flurometri pada panjang gelombang eksitasi 350 nm dan emisi 444 nm

Peralatan :

a.         Corong dan botol filtrate contoh;

b.         Homogenizer (blender);

c.          Kertas saring kasar, plastic, karet pengikat;

d.         Kolom resin 20 cm X 0,8 cm, reservoir 2 cm X 5 cm;

e.         Labu Takar 25 ml, 50 ml, 100 ml dan 1.000 ml;

f.           Pipet volumetric;

g.         Spektroflurometer;

h.         Stirer-plate;

i.           Tabung reaksi 50 ml bertutup;

j.           Timbangan analitis;

k.         Waterbath.

 

Alat Spectrolorometri, Perkin Elemer LS 45

Kolom untuk tahap elusi

Pereaksi :

a.    Metanol;

b.    Aquades;

c.     Glasswool;

d.    NaOH 1 N: Larutkan 4 g NaOH dalam 100 ml Aquades

e.    HCl 0,1 N: Encerkan 8 ml HCl 12,5 N (37 %) dalam 1.000 ml Aquades

f.   Orto-ptalatdikarboksildehid (OPT) 0,1 % : Larutkan 0,1 g OPT dalam 100 ml methanol, larutan ini disiapkan pada kondisi segar dalam setiap analisa

g.  Asam Phosphat (H₃PO₄) 3,57 N: Encerkan 121,8 ml H₃PO₄ (85%) menjadi 1.000 ml aquades, standarkan larutan ini dengan mengambil 5 ml dan titrasi dengan NaOH 1 N dengan indicator fenolftalin)

h.    Resin penukar ion jenis Dowex 1 – X8 50 – 100 mesh

i.      Pembuatan larutan standar histamine

·         Larutan stok 1 mg/ml (1.000 ppm)

  Timbang teliti 169,1 mg Histamin 2 HCl, larutkan dan tepatkan menggunakan HCl 0,1 N dalam labu takar 100 ml sampai batas volume.  Siapkan larutan ini dalam kondisi segar setiap minggu dan disimpan dalam refrigerator

·           Larutan stock 10 µl/ml (10 ppm)

   Pipet 1 ml larutkan stock (1.000 ppm) masukkan ke dalam labu takar 100 ml dan  tambahkan larutan HCl 0,1 sampai batas volume.  Siapkan larutan ini dalam kondisi segar setiap minggu dan disimpan dalam refrigerator

j.      Larutan kerja

Buat larutan kerja 0,1 µg/ml (0,1 ppm); 0,2 µg/ml (0,2 ppm); 0,3 µg/ml (0,3 ppm).

Siapkan larutan kerja ini setiap hari (setiap akan digunakan).  Apabila larutan kerja tersebut menghasilkan fluorosensinya yang maksimal pada pembacaan dengan instrument, maka larutan kerja tersebut dapat diencerkan sesuai dengan keperluan

Prosedur Analisis:

1. Preparasi contoh

a.  Blender contoh hingga homogen

b. Timbang seksama lebih kurang 10 g contoh dalam beaker glass 250 ml dan tambahkan 50 ml methanol, blender hingga homogen

c. Panaskan diatas waterbath selama 15 menit pada suhu 60 ^oC dijaga sample dalam kondisi tertutup, dinginkan hingga suhu kamar

d. Tuangkan contoh ke dalam labi takar 100 ml dan tepatkan hingga volume labu dengan methanol

e. Saring menggunakan kertas saring dan filtratnya ditampung dalam botol contoh. Pada tahap ini filtrate contoh dapat disimpan dalam refrigerator

2. Persiapan Resin

a)   Timbang 3 gram resin untuk setiap kolom dalam beaker glass 250 ml

b)  Tambahkan 15 ml NaOH 2 N/g resin untuk mengubah resin menjadi bentuk OH

c)   Aduk menggunkan stirrer- plate selama 30 menit

d)  Tuang cairan pada bagian atas dan ulangi penambahan NaOH 2 N dengan jumlah yang sama

e)   Cuci/bilas resin dengan aquades sebanyak 3 kali

f)    Saring melalui kertas saring No. 588 atau yang setara dan cuci kembali aquades

g)   Siapkan resin setiap minggu dan simpan dalam aquades

3. Persiapan Kolom Resin

a)   Masukkan glasswool ke dalam kolom resin setinggi ± 1,5 cm

b)  Masukkan resin dalam medium air ke kolom resin setinggi ± 8 cm, pertahankan volume air yang berada di atas resin ± 1 cm, jangan dibiarkan kering.

c)   Letakkan labu takar 50 ml yang sudah berisi 5 ml HCl 1 N di bawah kolom resin guna menampung elusi contoh yang dilewatkan pada kolom resin.  Diperlihatkan dalam gambar di bawah ini

4. Pemurnian Contoh

a)   Pipet 1 ml Filtrat contoh, masukkan dalam kolom resin, kran kolom resin dalam posisi terbuka biarkan aliran menetes (hasil elusi) ditampung dalam labu takar 50 ml

b)  Tambahkan aquades pada saat tinggi cairan ± 1 cm di atas resin dan biarkan cairan terelusi. Lakukan seterusnya hingga hasil elusi dalam labu takar tepat 50 ml.  Hasil elusi (contoh) dapat disimpan dalam refrigerator.

5. Pembentukan Senyawa Turunan (derivatisasi)

Siapkan tabung reaksi 50 ml masing-masing untuk contoh, standard an blanko

a)       Pipet masing-masing 5 ml filtrate contoh, larutan standar kerja dan blanko (HCl 0.1 N)

b)       Tambahkan ke dalam tabung reaksi di atas berturut-turut;

·   10 ml HCl 0,1 N kocok

·  3 ml NaOH 1 N, kocok, dalam waktu 5 menit harus sudah ditambah 1 ml OPT 0,1%, kocok dan biarkan selama $ menit

·   3 ml H₃PO₄ 3,57 N kocok

c)        Lakukan pengukuran fluorosence terhadap contoh, standar dan blanko sesegera mungkin dengan alat spectrofluorometer pada panjang gelombang exsitasi: 350 nm dan emisi: 444 nm dalam jangka waktu 90 menit.

Perhitungan

1. Masukkan harga konsentrasi dan fluoresensi dari larutan standar kerja ke dalam program linier kalkulator.  Nilai: koefisien regresi ( R ), slope (b) dari intersep (a) digunakan untuk menghitung konsentrasi contoh.  Masukkan harga fluoresence contoh ke persamaan regresi standar:
   

1. 2.  Setelah didapat harga x , kalikan dengan faktor pengenceran dan kembalikan ke berat contoh. Nyatakan kandungan histamin dalam  (µg/g) atau mg / kg contoh.

Pelaporan

a. Jika angka desimal kurang dari 5 (lima) maka pembulatan ke bawah, tetapi bila lebih dari 5 (lima) pembulatan ke atas.Contoh :

     14,454 dibulatkan menjadi 14,76

     14,466 dibulatkan menjadi 14,47

b. Jika angka ke tiga di belakang koma 5 (lima), dan angka kedua genap, maka angka lima tersebut menjadi hilang tapi bila angka kedua ganjil maka pembulatan ke atas. Contoh :

     14,765 dibulatkan menjadi 14,76

     14,475 dibulatkan menjadi 14,48

Keamanan dan Keselamatan Kerja

Untuk menjaga keamanan dan keselamatan kerja selama melakukan analisa maka perlu diperhatikan hal-hal sebagai berikut :

a.              Cuci tangan sebelum dan sesudah melakukan analisa.

b.             Gunakan jas laboratorium selama bekerja.

Acuan : SNI – 01 – 2354.10 : 2009