Metode Pengujian Mercury (Hg) dengan AAS

Prinsip: Unsur Merkuri (Hg) dilepaskan dari jaringan contoh melalui tahap digesti dengan menggunakan asam sulfat pekat dan nitrat pekat dengan bantuan pemanas listrik untuk mendapatkan unsur merkuri bermuatan positif (Hg⁺ atau Hg⁺⁺ ). 

Penetapan jumlah merkuri dilakukan dengan spektrofotometer serapan atom tanpa nyala (flameless AAS) dimana unsur merkuri positif ini selanjutnya direduksi dengan Natrium borohidrid menjadi Hg netral dalam bentuk kabut uap merkuri.  Kabut uap merkuri didorong oleh gas mulia argon menuju sel penyerapan pada AAS, dan berinteraksi dengan sinar yang berasal dari lampu katoda merkuri (Hallow Cathode Lamp).  Interaksi tersebut berupa sinar yang besarnya dapat dilihat pada layar monitor AAS.  Jumlah serapan sinar sebanding dengan kadar merkuri yang ada dalam contoh. Metoda ini dapat diterapkan untuk menetapkan kandungan mercury pada kerang-kerangan, udang, air tambak, dan lumpur tambak serta produk perikanan lainnya.

Peralatan

a.       Timbangan analitik ketelitian 0,0001 g

b.       Pipet Volumetrik 1 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml, 50 ml*

c.       Mikropipet*

d.       Pipet Tetes*

e.       Wadah polystyrene

f.        Botol polypropylene*

g.       Sendok plastic*

h.       Cawan Petri ukuran 15 mm x 100 mm*

i.         Pisau*

j.         Aluminium Foil

k.       Gelas piala 25 ml, 100 ml dan 250 ml*

l.         Corong Gelas*

m.    Penyangga dan statip

n.       Desikator

o.       Pemanas listrik

p.       Blender / homogenizer

q.       Oven

r.        Refrigerator

s.        Labu alas bulat kapasitas 250 ml dengan pendingin*

t.        Labu takar kapasitas 50 ml, 100 ml, 1000 ml*

u.       Seperangkat alat spektrofotometer serapan atom (Atomic Absorption Spectrophotometer)                      dilengkapi dengan flameless

Catatan *) Semua peralatan yang dipergunakan harus terlebih dahulu direndam dalam HNO₃:air deionisasi (1:9) kemudian dibilas dengan air deionisasi

Pereaksi

a.       Air deionisasi

b.       Asam klorida (HCl), fuming 37%

c.       Larutan HCl 3% (v/v): Pipet 30 ml HCL 37% (pekat) larutkan dalam labu takar 1 L dengan air           deionisasi dan tepatkan

d.       Natrium Hidroksida (NaOH) pelets,

e.       NaOH 0,005% (w/v): Larutkan 0,05 g NaOH dalam 1 L air deionisasi dan tepatkan

f.        Natrium borohibrid (NaBH₄)

g.       Larutkan 0,2 g NaBH4 dalam 1 L NaOH 0,005%. Larutan disiapkan pada saat akan dilakukan              analisa

h.       Asam nitrat (HNO₃) 65%

i.         Asam sulfat (H₂SO₄) 95%-97%

j.         HNO₃ - H₂SO₄ (1+1) 20% (v/v): Campurkan 100 ml HNO₃ dengan 100 ml H₂SO_4, encerkan              dengan air deionisasi dan tepatkan sampai 1 L

k.       Hidrogen Peroksida (H₂O₂) 30%

l.         Batu didih

m.    Larutan Standar merkuri

•  Larutan Standar Primer 1000 mg/l
• Larutan Standar sekunder pertama (i) : 10 mg/l
• Pipet 1 ml larutan Standar Primer 1000 mg/l, masukkan ke dalam labu takar 100 ml dan encerkan dengan larutan HNO₃ - H₂SO₄ (1+1) 20% (v/v).  Larutan standar ini dapat disimpan selama 1 bulan di dalam botol propylene pada refrigerator.
• Larutan Standar sekunder ke dua  (ii) : 1 mg/l
• Pipet 5 ml larutan Standar sekunder pertama (i), masukkan ke dalam labu takar 50 ml dan encerkan dengan larutan HNO₃ - H₂SO₄ (1+1) 20% (v/v).  Larutan standar ini dapat disimpan selama 1 bulan di dalam botol propylene pada refrigerator.
• Larutan Standar sekunder ke dua  (iii) : 100 µg/l
• Pipet 5 ml larutan Standar sekunder ke dua (ii), masukkan ke dalam labu takar 50 ml dan encerkan dengan larutan HNO₃ - H₂SO₄ (1+1) 20% (v/v).  Larutan standar ini dapat disimpan selama 1 minggu di dalam botol propylene pada refrigerator.
• Larutan standar Kerja (5 µg/l, 10 µg/l dan 20 µg/l )
• Pipet 5 ml, 10 ml, dan 20 ml dari  larutan Standar sekunder ke tiga (iii), masukkan ke dalam labu takar 100 ml dan encerkan dengan larutan HNO₃ - H₂SO₄ (1+1) 20% (v/v).  Larutan standar kerja  ini dibuat ketika akan melakukan analisa

Preparasi Contoh

• Produk kering: Lumatkan / haluskan contoh hingga menjadi partikel kecil.  Tempatkan contoh dalam wadah polysterene yang bersih dan bertutup.  Jika contoh tidak langsung diuji, simpan contoh suhu ruang sampai saatnya untuk dianalisa
• Produk basah: Lumatkan / haluskan contoh hingga homogen dan tempatkan homogenat dalam wadah polystyrene yang bersih dan bertutup.  Jika contoh tidak langsung diuji, simpan contoh dalam freezer sampai saatnya untuk dianalisa.  Pastikan contoh masih tetap homogen sebelum ditimbang.  Jika terjadi pemisahan antara cairan dan contoh maka dilakukan pengadukan/blender ulang sebelum dilakukan analisa. 

Prosedur  :

Produk basah dengan proses pengeringan

• Beri label pada cawan petri, tutup separuh permukaan cawan petri dengan aluminium foil untuk mengurangi kontaminasi dari debu selama pengerinagan, kemudian masukkan ke dalam oven pada suhu 103⁰C ± 1⁰C selama 2 jam
• Dinginkan cawan petri ke dalam desikator selama 30 menit, timbang dan catat (A)
• Masukkan contoh basah ke dalam cawan petri dan ratakan dengan menggunakan sendok plastic, timbang berat contoh basah dan cawan petri (B)
• Tutup separuh cawan petri dengan aluminium foil dan keringkan dalam oven selama 18 jam pada suhu 103⁰C ± 1⁰C
• Dinginkan contoh ke dalam desikator selama 30 menit, timbang ( C ) dan tentukan kadar air contoh
• Haluskan contoh kering dan simpan contoh kering dan simpan contoh di dalam botol polypropylene

·    Tahap Digesti

• Keringkan labu alas bulat 250 ml dalam oven pada suhu 103⁰C ± 1⁰C selama 2 jam
• Dinginkan labu alas bulat ke dalam desikator selama 30 menit, timbang dan catat
• Timbang produk basah (6.2) sebanyak 5 g atau produk kering (6.1) sebanyak 0,2 g dan catat beratnya (W).  Untuk produk basah dengan proses pengeringan (7.1) timbang sebanyak 0,2 g dan catat beratnya (Wd).
• Untuk control positif (Spike), tambahkan 0,5 ml larutan standar merkuri 1 mg/l ke dalam contoh sebelum dimasukkan batu didih
• Tambahkan 3 buah – 5 buah batu didih
• Tambahkan 10 mg – 20 mg V₂O₅
• Tambahkan berturut-tururt 10 ml HNO₃ 65% dan 10 ml H₂SO₄ 95% - 97%
• Lakukan pemanasan dengan panas yang rendah sampai mendidih secara perlahan selama kurang lebih 6 menit (untuk mencegah tumpahnya contoh), kemudian pemanasan dilanjutkan dengan panas yang lebih tinggi untuk menghasilkan larutan berwarna coklat kekuningan yang bening (clearly yellowfish brown).  Goyangkan labu selama digesti berlangsung sampai zat padat tidak ada lagi kecuali apungan lemak yang tampak setelah didinginkan pada suhu ruang selama kurang lebih 4 menit.
• Bilas pendingin dengan 15 ml air deionisasi.  Tambahkan 2 tetes H₂O₂ 30% melalui ujung atas pendingin, kemudian bilas pendingin dengan 15 ml air deionisasi

CATATAN: Untuk memperoleh hasil digesti yang optimal, produk basah sebaiknya melalui proses pengeringan terlebih dahulu

Tahap Pembacaan pada AAS

a.       Siapkan larutan standar minimal dengan tiga titik kadar (5 µg/l, 10 µg/l dan 20 µg/l )

b.       Contoh, spiked dan larutan standar kemudian dibaca pada panjang gelombang (λ) 253,7 nm

c.       Tentukan kadar contoh berdasarkan kurva kalibrasi

Perhitungan

CATATAN:

1.         Jika hasil pembacaan kadar contoh dan spiked pada AAS lebih tinggi dari dari kadar larutan standar yang digunakan, maka lakukan pengenceran.

2.          µg/g setara mg/kg

Pelaporan

a.       Jika diperoleh angka decimal kurang dari 5 (lima) maka pembulatan ke turun, tetapi bila lebih dari 5 (lima) pembulatan naik.

CONTOH:     @ 14,454 dibulatkan menjadi 14,45

@ 14,466 dibulatkan menjadi 14,47

 b. Jika diperoleh angka decimal 5 (lima) yang akan dibulatkan dari angka genap yang ada didepannya, maka angka lima tersebut menjadi hilang, tetapi bila angka di depannya ganjil maka pembulatan akan naik

CONTOH:     @ 14,765 dibulatkan menjadi 14,76

         @ 14,475 dibulatkan menjadi 14,48

Keamanan dan Keselamatan Kerja 

Untuk menjaga keamanan dan keselamatan kerja selama melakukan analisa Hg maka perlu diperhatikan hal-hal sebagai berikut:

a)   Cuci tangan sebelum dan sesudah melakukan analisa;

b)   Gunakan jas laboratorium dan masker selama bekerja;

c)   Pastikan blower lemari asam dan blower AAS berfungsi dengan baik;

d)   Pastikan aliran gas ditutup kembali setelah selesai analisa;

e)   Untuk menjaga kesehatan (mengantisipasi toxisitas) analis diperlukan minum susu tiap hari.

Acuan : SNI 01-2354.6-2006

Pengujian Coliform dan E. COLI

Metode ini digunakan untuk menentukan bakteri indikator sanitasi yaitu Coliform  dan  Escherichia coli atau yang bisa disebut E.Coli. 

Media dan Reagensia :

a.    Brilliant Green Lactose Bile Broth 2%(BGLB) 

b.    Lauryl Tryptose  Broth (LSB) 

c.    EC Broth 

d.    Levine’s Eosin Methylen Blue (L-EMB) Agar 

e.    Tryptone ( Trytophane ) Broth ( TB )  

f.     MR-VP Broth 

g.    Simmon Citrate Agar 

h.    Plate Count Agar  

i.      Larutan Butterfield’s Phosphate Buffered 

j.     Pereaksi Kovaks 

k.    Pereaksi Voges Preskauer 

l.      Indikator MR 

m.  Pereaksi pewarnaan gram

Peralatan

a.    Waterbath bertutup dengan sirkulasi 45 ^oC ± 0,5 ^oC ;

b.    Inkubator 35 ^oC ± 1 ^oC;

c.    Blender beserta jar yang dapat distrerilisasi atau stomacher ;

d.    Botol pengencer ;

e.    Tabung durham ;

f.     Cawan petri ukuran 15 mm X 90 mm;

g.    Tabung reaksi ukuran 16 mm x 150 mm dan 13 mm x 100mm;

h.    Timbangan dengan ketelitian 0,0001 g;

i.      mikroskop

j.     pipet atau pippetor 1 ml, 5 ml dan 10 ml.

Kondisi Pengujian Pengujian contoh kekerangan menggunakan 5 seri tabung pengencer sedangkan untuk produk perikanan lainnya menggunakan 3 seri tabung pengencer

Preparasi contoh Dengan menerapkan teknik aseptis, contoh diambil secara acak dan dipotong kecil-kecil hingga berat masing-masing contoh yang akan diuji sesuai ketentuan pada tabel dibawah. Contoh beku dilelehkan pada saat akan dianalisa dan pelelehan dilakukan selama 18 jam pada suhu sekitar 2^oC – 5^oC dan tidak lebih dari 15 menit.

Prosedur Pengujian

1. Persiapan contoh

• Untuk contoh dengan berat lebih kecil atau sama dengan 1 kg atau 1 l sampai dengan 4,5 kg atau 4,5 l timbang contoh padat sebanyak 25 g atau contoh cair sebanyak 25 ml dari contoh yang akan diuji, kemudian masukkan dalam wadah atau plastik steril dan tambahkan 225 ml larutan Butterfield’s phosphate Buffered
• Untuk contoh dengan berat lebih besar dari 4,5 kg atau 4,5 l timbang contoh padat sebanyak 50 g atau contoh cair sebanyak 50 ml, kemudian masukkan dalam wadah atau plastik steril dan tambahkan 450 ml larutan Butterfield’s phosphate Buffered
• Homogenkan selama 2 menit. Homogenat ini merupakan larutan dengan pengenceran 10^-1

2.           Tahap Analisa

·               Tahap Uji Pendugaan coliform  (Presumptive  coliform)

• Siapkan pengenceran 10^-2 dengan cara melarutkan larutan 10^-1 ke dalam 9 ml larutan pengencer Butterfield’s phosphate Buffered. Lakukan pengenceran selanjutnya sesuai dengan pendugaan kepadatan populasi contoh. Pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali.
• Pindahkan dengan menggunakan pipet steril, sebanyak 1 ml larutan dari setiap pengenceran ke dalam 3 seri atau 5 seri tabung lauryl tryptose broth ( LTB ) yang berisi tabung durham.
• Inkubasi tabung-tabung tersebut selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC. Perhatikan gas yang terbentuk setelah inkubasi 24 jam dan inkubasi kembali tabung-tabung negatif selama 24 jam. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan gas gas dalam tabung durham.
• Lakukan “ uji penegasan coliform” untuk tabung-tabung positif.

·                       Uji Penegasan  coliform ( Confirmed coliform )

• Inokulasi tabung-tabung LTB yang positif ke tabung-tabung BGLB Broth yang berisi tabung durham dengan menggunakan jarum ose. Inkubasi BGLB Broth yang telah diinokulasi selama 48 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC.
• Periksa tabung-tabung BGLB yang menghasilkan gas selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.
• Tentukan nilai paling memungkinkan ( APM ) berdasarkan jumlah tabung-tabung yang positif dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan ( APM ). Nyatakan nilainya sebagai “ APM/g coliform”

·                      Uji pendugaan Escherichia coli ( faecal coliform presumptive  Escherichia coli )

• Inokulasi dari setiap tabung LTB yang positif ke tabung-tabung EC broth yang berisi tabung durham dengan menggunakan jarum ose , Inkubasi EC broth  dalam  sirkulasi waterbath selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 45^oC ± 0,5^oC. Waterbath harus dalam keadaan bersih, air di dalamnya harus lebih tinggi dari tinggi cairan yang ada dalam tabung yang akan diinkubasi.
• Periksa tabung-tabung EC broth yang menghasilkan gas selama 24 jam ± 2 jam, jika negatif inkubasi kembali sampai 48 jam ± 2 jam. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.
•  Tentukan nilai angka paling memungkinkan ( APM ) berdasarkan jumlah tabung-tabung EC yang  positif dengan  menggunakan  Angka  Paling  Memungkinkan     ( APM ). Nyatakan nilainya sebagai “ APM/g faecal coliform “

·                      Uji penegasan Escherichia coli ( confirmed Escherichia coli )

• Dari tabung-tabung EC broth  yang positif dengan menggunakan jarum ose gores ke L-EMB agar. Inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC.
• Koloni Escherichia coli terduga memberikan ciri yang khas ( typical ) yaitu hitam pada bagian tengah dengan atau tanpa hijau metalik.
• Ambil lebih dari satu koloni ( typical ) Escherichia coli dari masing-masing cawan   L-EMB dan goreskan ke media PCA miring dengan menggunakan jarum tanam. Inkubasi selama  24 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC.
•  Jika koloni yang khas (typical) tidak ada, pindahkan 1 atau lebih koloni yang tidak khas ( typical ) Escherichia coli  ke media PCA miring.

                     Uji Morfologi

Lakukan uji morfologi dengan melakukan pewarnaan gram dari setiap koloni Escherichia coli  24 jam ± 2 jam dengan menggunakan mikroskop, bakteri  Escherichia coli   termasuk bakteri gram negatif, berbentuk batang pendek atau coccus.

                   Uji Biokimia

a.  Produksi Indol ( I )

Inokulasi 1 ose dari PCA miring ke dalam tryptone broth inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC. Uji indol dilakukan dengan menambahkan 0,2 ml – 0,3 ml pereaksi kovacs. Reaksi positif jika terbentuk cincin merah pada lapisan bagian atas media dan negatif bila terbentuk cincin warna kuning.

b.   Uji voges proskauer ( VP )

Inokulasi 1 ose dari PCA   miring ke dalam MRVP broth. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC. Pindahkan sebanyak 1 ml dari setiap MRVP broth yang tumbuh ke dalam tabung reaksi ukuran 13 mm X 100 mm steril dan tambahkan 0,6 ml larutan alpa naphtol dan 0,2 ml  40 % KOH. Kocok, tambahkan sedikit kristal kreatin untuk mempercepat reaksi. Kocok kembali dan diamkan selama 2 jam. Reaksi positif jika terbentuk warna merah muda eosin sampai merah mirah delima (ruby)

c. Uji methyl red ( MR )

Inkubasi kembali MRVP broth selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC. Tambahkan 5 tetes Methyl red pada setiap MRVP broth. Reaksi positif jika terbentuk warna merah dan negatif jika terbentuk warna kuning.

d. Uji Citrat (C)

Goreskan 1 ose dari PCA miring ke permukaan simmon citrat agar. Inkubasi selama 96 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC. Reaksi  positif jika terjadi pertumbuhan dan media berubah warna menjadi biru, reaksi negatif jika tidak ada pertumbuhan dan media tetap hijau.

e. Produksi gas dari laktosa

Inokulasi 1 ose dari PCA miring ke dalam LTB. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC reaksi positif jika menghasilkan gas pada tabung durham.

Pelaporan
Berdasarkan interpretasi hasil diatas, nyatakan coliform dan Escherichia coli  dalam APM/g dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan ( APM). Apabila pengujian menggunakan 3 seri tabung pengeceran gunakan tabel B1 lampiran B dan Apabila pengujian menggunakan 5 seri tabung pengenceran gunakan tabel C1 pada lapiran C

Keamanan dan Keselamatan Kerja ( K3 )
Untuk menjaga keamanan dan keselamatan kerja selama melakukan analisa maka perlu diperhatikan hal-hal sebagai berikut :

• Cuci tangan sebelum dan sesudah melakukan analisa
• Gunakan jas lab selama melakukan analisa
• Bersihkan meja kerja sebelum dan sesudah melakukan analisa
• Bersihkan segera contoh yang tercecer dan mengandung bakteri dengan menggunakan bahan desinfektan
• Media yang sudah digunakan disterilkan terlebih dahulu sebelum dibuang

Angka Paling Memingkinkan / APM dengan seri tabung pengenceran

A.1 Latar belakang

Metode untuk menduga jumlah bakteri dalam suatu produk, dapat menggunakan metode hitungan mikroskopis, metode hitungan cawan dan penentuan angka paling memungkinkan(APM). Organisme yang mati maupun hidup dapat dihitung dengan metode hitungan mikroskopis, akan tetapi pada APM hanya organisme hidup yang dapat dihitung.

Metode APM adalah metode untuk menghitung jumlah mikroba dengan menggunakan medium cair dalam tabung reaksi yang pada umumnya setiap pengenceran menggunakan 3 atau 5 seri tabung dan perhitungan yang dilakukan merupakan tahap pendekatan secara statistik. Tabung positif ditunjukan oleh adanya pertumbuhan bakteri dan gas. Nilai APM ini diperoleh dengan anggapan sebagai berikut: 

a.    Bakteri dalam contoh menyebar secara random

b.    Bakteri dalam contoh tidak berkelompok atau cluster, tetapi saling terpisah

c.    Organisme yang terdapat dalam contoh dapat tumbuh dalam medium selama inkubasi

d.    Kondisi yang sesuai untuk pertumbuhan, seperti media dan waktu inkubasi

Didalam penggunaan seri tabung pengenceran tingkat pengenceran yang diperlukan didasarkan pada pendugaan populasi bakteri yang ada dalam contoh. Hasil yang baik adalah jika pada pengenceran yang lebih rendah contoh yang diduga lebih banyak menunjukkan hasil uji positif ( adanya pertumbuhan bakteri) dan pada pengenceran lebih tinggi contoh yang diduga lebih sedikit menunjukkan hasil uji negatif (tidak ada pertumbuhan bakteri). Oleh karena itu jumlah populasi bakteri yang ada dalam contoh diduga tinggi maka contoh harus diencerkan sampai diperoleh tingkat pengeceran yang lebih tinggi sehingga nilai APM maksimum yang dapat dihitung. Metode pengenceran yang paling mudah adalah dengan melakukan pengeceran 10 kali lipat dengan menggunakan 3 atau 5 seri tabung pengenceran.

Metode APM digunakan untuk menduga organisme dalam jumlah sedikit (kurang dari 100/g) terutama susu, air dan makanan yang mempunyai partikel-partikel lain yang mungkin mengganggu keakurasian perhitungan. Kombinasi tabung-tabung positif yang diperoleh cukup untuk memberikan hasil yang signifikan dan umumnya terdapat dalam tabel APM, sedangkan kombinasi yang tidak mungkin diabaikan. Tabel APM mempunyai tingkat kepercayaan 95 %. Jika kombinasi tabung-tabung positif yang diperoleh tidak termasuk dalam tabel APM maka contoh yang asli harus dilakukan pengujian kembali. Dan jika ini tidak dapat dilakukan, maka analis harus membandingkan dengan tabel APM yang lain untuk menghitung nilai APM berdasarkan hasil yang diperoleh.

A.2 Cara pemilihan kombinasi tabung positif pada 3 dan 5 seri tabung pengenceran dalam tabel APM

Penentuan APM dihitung berdasarkan jumlah seri tabung positif pada beberapa pengenceran yang digunakan yang didasarkan pada 3 atau 5 seri tabung pengenceran yang digunakan. Kombinasi yang diambil adalah 3 tingkat pengenceran dengan kaidah sebagai berikut :

Kasus 1 seluruh tabung pada seri tabung pengenceran ( 10^-1 , 10^-2 , dst ) menunjukkan reaksi positifpilih tingkat pengenceran tertinggi yang menghasilkan seluruh tabung positif dan 2 pengenceran berikutnya seperti contoh a dan a ( tabel A).

• Jika pada tingkat pengenceran yang paling tinggi masih menghasilkan tabung positif (tingkat pengenceran 10^-3 menghasilkan 1 tabung positif) maka tingkat pengenceran tersebut tingkat pengenceran tertinggi yang dipilih, seperti pada contoh c (Tabel A).
• Jika pada tingkat pengenceran tertentu menghasilkan tabung negatif (tingkat pengenceran 10^-3) tetapi pengenceran berikutnya menghasilkan tabung positif (tingkat pengenceran 10^-4 menghasilkan 1 tabung positif ) maka yang dinyatakan tabung positif adalah tingkat pengenceran sebelumnya seperti pada contoh d ( Tabel A).
• Jika pada tingkat pengeceran tertinggi (10^-4) masih terdapat tabung positif, maka pilih tingkat pengenceran sebelumnya seperti pada contoh e (Tabel A). 

Kasus 2 Tidak ada satupun dari seri pengenceran yang menghasilkan seluruh tabung positif

a.    Lihat pada contoh f (tabel A), jika tingkat pengenceran tertentu menghasilkan tabung positif (10^-2) maka pilih 2 tingkat pengenceran sebelumnya

b.  Jika pada pengenceran yang lebih tinggi masih menghasilkan tabung positif ( pengenceran 10^-3 menghasilkan 1 tabung positif ) maka tambahkan tabung positif tersebut ke tingkat pengenceran sebelumnya seperti pada Tabel A (Contoh g).

Acuan:  SNI. 01-2332.1 -2006