Pengujian Coliform dan E. COLI

Metode ini digunakan untuk menentukan bakteri indikator sanitasi yaitu Coliform  dan  Escherichia coli atau yang bisa disebut E.Coli. 

Media dan Reagensia :

a.    Brilliant Green Lactose Bile Broth 2%(BGLB) 

b.    Lauryl Tryptose  Broth (LSB) 

c.    EC Broth 

d.    Levine’s Eosin Methylen Blue (L-EMB) Agar 

e.    Tryptone ( Trytophane ) Broth ( TB )  

f.     MR-VP Broth 

g.    Simmon Citrate Agar 

h.    Plate Count Agar  

i.      Larutan Butterfield’s Phosphate Buffered 

j.     Pereaksi Kovaks 

k.    Pereaksi Voges Preskauer 

l.      Indikator MR 

m.  Pereaksi pewarnaan gram

Peralatan

a.    Waterbath bertutup dengan sirkulasi 45 ^oC ± 0,5 ^oC ;

b.    Inkubator 35 ^oC ± 1 ^oC;

c.    Blender beserta jar yang dapat distrerilisasi atau stomacher ;

d.    Botol pengencer ;

e.    Tabung durham ;

f.     Cawan petri ukuran 15 mm X 90 mm;

g.    Tabung reaksi ukuran 16 mm x 150 mm dan 13 mm x 100mm;

h.    Timbangan dengan ketelitian 0,0001 g;

i.      mikroskop

j.     pipet atau pippetor 1 ml, 5 ml dan 10 ml.

Kondisi Pengujian Pengujian contoh kekerangan menggunakan 5 seri tabung pengencer sedangkan untuk produk perikanan lainnya menggunakan 3 seri tabung pengencer

Preparasi contoh Dengan menerapkan teknik aseptis, contoh diambil secara acak dan dipotong kecil-kecil hingga berat masing-masing contoh yang akan diuji sesuai ketentuan pada tabel dibawah. Contoh beku dilelehkan pada saat akan dianalisa dan pelelehan dilakukan selama 18 jam pada suhu sekitar 2^oC – 5^oC dan tidak lebih dari 15 menit.

Prosedur Pengujian

1. Persiapan contoh

• Untuk contoh dengan berat lebih kecil atau sama dengan 1 kg atau 1 l sampai dengan 4,5 kg atau 4,5 l timbang contoh padat sebanyak 25 g atau contoh cair sebanyak 25 ml dari contoh yang akan diuji, kemudian masukkan dalam wadah atau plastik steril dan tambahkan 225 ml larutan Butterfield’s phosphate Buffered
• Untuk contoh dengan berat lebih besar dari 4,5 kg atau 4,5 l timbang contoh padat sebanyak 50 g atau contoh cair sebanyak 50 ml, kemudian masukkan dalam wadah atau plastik steril dan tambahkan 450 ml larutan Butterfield’s phosphate Buffered
• Homogenkan selama 2 menit. Homogenat ini merupakan larutan dengan pengenceran 10^-1

2.           Tahap Analisa

·               Tahap Uji Pendugaan coliform  (Presumptive  coliform)

• Siapkan pengenceran 10^-2 dengan cara melarutkan larutan 10^-1 ke dalam 9 ml larutan pengencer Butterfield’s phosphate Buffered. Lakukan pengenceran selanjutnya sesuai dengan pendugaan kepadatan populasi contoh. Pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali.
• Pindahkan dengan menggunakan pipet steril, sebanyak 1 ml larutan dari setiap pengenceran ke dalam 3 seri atau 5 seri tabung lauryl tryptose broth ( LTB ) yang berisi tabung durham.
• Inkubasi tabung-tabung tersebut selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC. Perhatikan gas yang terbentuk setelah inkubasi 24 jam dan inkubasi kembali tabung-tabung negatif selama 24 jam. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan gas gas dalam tabung durham.
• Lakukan “ uji penegasan coliform” untuk tabung-tabung positif.

·                       Uji Penegasan  coliform ( Confirmed coliform )

• Inokulasi tabung-tabung LTB yang positif ke tabung-tabung BGLB Broth yang berisi tabung durham dengan menggunakan jarum ose. Inkubasi BGLB Broth yang telah diinokulasi selama 48 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC.
• Periksa tabung-tabung BGLB yang menghasilkan gas selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.
• Tentukan nilai paling memungkinkan ( APM ) berdasarkan jumlah tabung-tabung yang positif dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan ( APM ). Nyatakan nilainya sebagai “ APM/g coliform”

·                      Uji pendugaan Escherichia coli ( faecal coliform presumptive  Escherichia coli )

• Inokulasi dari setiap tabung LTB yang positif ke tabung-tabung EC broth yang berisi tabung durham dengan menggunakan jarum ose , Inkubasi EC broth  dalam  sirkulasi waterbath selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 45^oC ± 0,5^oC. Waterbath harus dalam keadaan bersih, air di dalamnya harus lebih tinggi dari tinggi cairan yang ada dalam tabung yang akan diinkubasi.
• Periksa tabung-tabung EC broth yang menghasilkan gas selama 24 jam ± 2 jam, jika negatif inkubasi kembali sampai 48 jam ± 2 jam. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.
•  Tentukan nilai angka paling memungkinkan ( APM ) berdasarkan jumlah tabung-tabung EC yang  positif dengan  menggunakan  Angka  Paling  Memungkinkan     ( APM ). Nyatakan nilainya sebagai “ APM/g faecal coliform “

·                      Uji penegasan Escherichia coli ( confirmed Escherichia coli )

• Dari tabung-tabung EC broth  yang positif dengan menggunakan jarum ose gores ke L-EMB agar. Inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC.
• Koloni Escherichia coli terduga memberikan ciri yang khas ( typical ) yaitu hitam pada bagian tengah dengan atau tanpa hijau metalik.
• Ambil lebih dari satu koloni ( typical ) Escherichia coli dari masing-masing cawan   L-EMB dan goreskan ke media PCA miring dengan menggunakan jarum tanam. Inkubasi selama  24 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC.
•  Jika koloni yang khas (typical) tidak ada, pindahkan 1 atau lebih koloni yang tidak khas ( typical ) Escherichia coli  ke media PCA miring.

                     Uji Morfologi

Lakukan uji morfologi dengan melakukan pewarnaan gram dari setiap koloni Escherichia coli  24 jam ± 2 jam dengan menggunakan mikroskop, bakteri  Escherichia coli   termasuk bakteri gram negatif, berbentuk batang pendek atau coccus.

                   Uji Biokimia

a.  Produksi Indol ( I )

Inokulasi 1 ose dari PCA miring ke dalam tryptone broth inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC. Uji indol dilakukan dengan menambahkan 0,2 ml – 0,3 ml pereaksi kovacs. Reaksi positif jika terbentuk cincin merah pada lapisan bagian atas media dan negatif bila terbentuk cincin warna kuning.

b.   Uji voges proskauer ( VP )

Inokulasi 1 ose dari PCA   miring ke dalam MRVP broth. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC. Pindahkan sebanyak 1 ml dari setiap MRVP broth yang tumbuh ke dalam tabung reaksi ukuran 13 mm X 100 mm steril dan tambahkan 0,6 ml larutan alpa naphtol dan 0,2 ml  40 % KOH. Kocok, tambahkan sedikit kristal kreatin untuk mempercepat reaksi. Kocok kembali dan diamkan selama 2 jam. Reaksi positif jika terbentuk warna merah muda eosin sampai merah mirah delima (ruby)

c. Uji methyl red ( MR )

Inkubasi kembali MRVP broth selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC. Tambahkan 5 tetes Methyl red pada setiap MRVP broth. Reaksi positif jika terbentuk warna merah dan negatif jika terbentuk warna kuning.

d. Uji Citrat (C)

Goreskan 1 ose dari PCA miring ke permukaan simmon citrat agar. Inkubasi selama 96 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC. Reaksi  positif jika terjadi pertumbuhan dan media berubah warna menjadi biru, reaksi negatif jika tidak ada pertumbuhan dan media tetap hijau.

e. Produksi gas dari laktosa

Inokulasi 1 ose dari PCA miring ke dalam LTB. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC reaksi positif jika menghasilkan gas pada tabung durham.

Pelaporan
Berdasarkan interpretasi hasil diatas, nyatakan coliform dan Escherichia coli  dalam APM/g dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan ( APM). Apabila pengujian menggunakan 3 seri tabung pengeceran gunakan tabel B1 lampiran B dan Apabila pengujian menggunakan 5 seri tabung pengenceran gunakan tabel C1 pada lapiran C

Keamanan dan Keselamatan Kerja ( K3 )
Untuk menjaga keamanan dan keselamatan kerja selama melakukan analisa maka perlu diperhatikan hal-hal sebagai berikut :

• Cuci tangan sebelum dan sesudah melakukan analisa
• Gunakan jas lab selama melakukan analisa
• Bersihkan meja kerja sebelum dan sesudah melakukan analisa
• Bersihkan segera contoh yang tercecer dan mengandung bakteri dengan menggunakan bahan desinfektan
• Media yang sudah digunakan disterilkan terlebih dahulu sebelum dibuang

Angka Paling Memingkinkan / APM dengan seri tabung pengenceran

A.1 Latar belakang

Metode untuk menduga jumlah bakteri dalam suatu produk, dapat menggunakan metode hitungan mikroskopis, metode hitungan cawan dan penentuan angka paling memungkinkan(APM). Organisme yang mati maupun hidup dapat dihitung dengan metode hitungan mikroskopis, akan tetapi pada APM hanya organisme hidup yang dapat dihitung.

Metode APM adalah metode untuk menghitung jumlah mikroba dengan menggunakan medium cair dalam tabung reaksi yang pada umumnya setiap pengenceran menggunakan 3 atau 5 seri tabung dan perhitungan yang dilakukan merupakan tahap pendekatan secara statistik. Tabung positif ditunjukan oleh adanya pertumbuhan bakteri dan gas. Nilai APM ini diperoleh dengan anggapan sebagai berikut: 

a.    Bakteri dalam contoh menyebar secara random

b.    Bakteri dalam contoh tidak berkelompok atau cluster, tetapi saling terpisah

c.    Organisme yang terdapat dalam contoh dapat tumbuh dalam medium selama inkubasi

d.    Kondisi yang sesuai untuk pertumbuhan, seperti media dan waktu inkubasi

Didalam penggunaan seri tabung pengenceran tingkat pengenceran yang diperlukan didasarkan pada pendugaan populasi bakteri yang ada dalam contoh. Hasil yang baik adalah jika pada pengenceran yang lebih rendah contoh yang diduga lebih banyak menunjukkan hasil uji positif ( adanya pertumbuhan bakteri) dan pada pengenceran lebih tinggi contoh yang diduga lebih sedikit menunjukkan hasil uji negatif (tidak ada pertumbuhan bakteri). Oleh karena itu jumlah populasi bakteri yang ada dalam contoh diduga tinggi maka contoh harus diencerkan sampai diperoleh tingkat pengeceran yang lebih tinggi sehingga nilai APM maksimum yang dapat dihitung. Metode pengenceran yang paling mudah adalah dengan melakukan pengeceran 10 kali lipat dengan menggunakan 3 atau 5 seri tabung pengenceran.

Metode APM digunakan untuk menduga organisme dalam jumlah sedikit (kurang dari 100/g) terutama susu, air dan makanan yang mempunyai partikel-partikel lain yang mungkin mengganggu keakurasian perhitungan. Kombinasi tabung-tabung positif yang diperoleh cukup untuk memberikan hasil yang signifikan dan umumnya terdapat dalam tabel APM, sedangkan kombinasi yang tidak mungkin diabaikan. Tabel APM mempunyai tingkat kepercayaan 95 %. Jika kombinasi tabung-tabung positif yang diperoleh tidak termasuk dalam tabel APM maka contoh yang asli harus dilakukan pengujian kembali. Dan jika ini tidak dapat dilakukan, maka analis harus membandingkan dengan tabel APM yang lain untuk menghitung nilai APM berdasarkan hasil yang diperoleh.

A.2 Cara pemilihan kombinasi tabung positif pada 3 dan 5 seri tabung pengenceran dalam tabel APM

Penentuan APM dihitung berdasarkan jumlah seri tabung positif pada beberapa pengenceran yang digunakan yang didasarkan pada 3 atau 5 seri tabung pengenceran yang digunakan. Kombinasi yang diambil adalah 3 tingkat pengenceran dengan kaidah sebagai berikut :

Kasus 1 seluruh tabung pada seri tabung pengenceran ( 10^-1 , 10^-2 , dst ) menunjukkan reaksi positifpilih tingkat pengenceran tertinggi yang menghasilkan seluruh tabung positif dan 2 pengenceran berikutnya seperti contoh a dan a ( tabel A).

• Jika pada tingkat pengenceran yang paling tinggi masih menghasilkan tabung positif (tingkat pengenceran 10^-3 menghasilkan 1 tabung positif) maka tingkat pengenceran tersebut tingkat pengenceran tertinggi yang dipilih, seperti pada contoh c (Tabel A).
• Jika pada tingkat pengenceran tertentu menghasilkan tabung negatif (tingkat pengenceran 10^-3) tetapi pengenceran berikutnya menghasilkan tabung positif (tingkat pengenceran 10^-4 menghasilkan 1 tabung positif ) maka yang dinyatakan tabung positif adalah tingkat pengenceran sebelumnya seperti pada contoh d ( Tabel A).
• Jika pada tingkat pengeceran tertinggi (10^-4) masih terdapat tabung positif, maka pilih tingkat pengenceran sebelumnya seperti pada contoh e (Tabel A). 

Kasus 2 Tidak ada satupun dari seri pengenceran yang menghasilkan seluruh tabung positif

a.    Lihat pada contoh f (tabel A), jika tingkat pengenceran tertentu menghasilkan tabung positif (10^-2) maka pilih 2 tingkat pengenceran sebelumnya

b.  Jika pada pengenceran yang lebih tinggi masih menghasilkan tabung positif ( pengenceran 10^-3 menghasilkan 1 tabung positif ) maka tambahkan tabung positif tersebut ke tingkat pengenceran sebelumnya seperti pada Tabel A (Contoh g).

Acuan:  SNI. 01-2332.1 -2006