METODE PENENTUAN ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT)

1. Tujuan :  

    Metode penentuan angka lempeng total ini, digunakan untuk menentukan jumlah total mikroorganisme aerob dan anaerob ( psikrofilik, mesofilik dan termofilik).

2. Media dan Reagensia :

a. Plate Count Agar (SNI : M.53)

b. Larutan Butterfield’sphosphate Buffered (SNI : R.3)

c. Gas pack dan indikator air anaerob

3. Peralatan

a. Timbangan dengan ketelitian 0,0001 g

b. Autoclave

c. Inkubator 35 ± 1^o C 

d. Anaerobic jar

e. Cawan Petri 15 mm x 90 mm

f. Botol Pengencer 

g. Alat penghitung koloni

h. Blender beserta Jar yang dapat disterilisasi atau stomacher

i. Batang gelas bengkok diameter 3 mm-4mm,dengan panjang tangkai 15cm-20cm

j. Pipet gelas atau pipetor : 0,1 ml, 1 ml, 5 ml dan 10 ml

4. Kondisi

Pada metode cawan agar tuang, untuk menghindari berkurangnya populasi bakteri akibat panas yang berlebih maka media agar yang akan dituang mempunyai suhu 45^oC ± 1^o C

5. Preparasi contoh

5.1. Berat contoh yang akan diuji diambil dengan ketentuan sebagai berikut :

a.  Contoh dengan berat lebih kecil dari 1 kg

Dengan menerapkan teknik aseptis, ambil contoh secara acak dengan potong kecil-kecil hingga beratnya mencapai 100 g

b. Contoh dengan berat 1 –  4,5 kg

Dengan menerapkan teknik aseptis, ambil contoh secara acak dan potong kecil-kecil hingga beratnya mencapai 300 g

c. Contoh dengan berat lebih besar dari 4,5 kg

Dengan menerapkan teknik aseptis, ambil contoh secara acak dan potong kecil-kecil hingga beratnya mencapai 500 g

5.2. Timbang contoh secara aseptis sebanyak 25 gram untuk contoh dengan ketentuan a dan b dan 50 g untuk contoh  dengan ketentuan c diatas, kemudian masukkan dalam wadah atau plastik steril. Untuk contoh 25 g tambahkan 22 ml larutan  butterfield’sphosphate buffered dan untuk contoh 50 g tambahkan 450 ml larutan butterfield’sphosphate buffered homogenkan selama 2 menit. Homogenat ini merupakan larutan pengenceran 10^-1. Dengan menggunkan pipit steril, ambil 1 ml homogenat diatas dan masukkan ke dalam 9 ml larutan butterfield’sphosphate buffered untuk mendapatkan pengenceran 10^-2. Siapkan pengenceran selanjutnya (10^-3) dengan mengambil 1 ml contoh pengenceran 10^-2  ke dalam 9 ml larutan butterfield’sphosphate buffered. Pada setian pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali. Selanjutnya lakukan hal yang sama untuk pengeceran 10^-4, 10^-5 dst sesuai kondisi contoh

6. Prosedur 

6.1. Metode cawan agar tuang / pour plate method

a. Pipet 1 ml dari setiap pengenceran 10^-1, 10^-2, dst dan masukkan ke dalam cawan petri steril. Lakukan secara duplo untuk setiap pengenceran

b. Tambahkan 12 ml –15 ml PCA tuang sudah didinginkan dalam waterbath hingga mencapai suhu 45^oC ± 1^oC ke dalam masing-masing cawan yang sudah berisi contoh. Supaya contoh dan media PCA tercampur sempurna lakukan pemutaran cawan ke depan ke belakang dan ke kiri – ke kanan

CATATAN : untuk pengujian bakteri termofilik, penambahan media PCA ke dalam cawan sebanyak 40 ml – 50 ml

c. Setelah  agar menjadi padat, untuk penentuan mikroorganisme aerob inkubasi cawan-cawan tersebut dalam posisi terbalik dalam inkubator selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 22^oC ± 1oC (psikrofilik); 35^oC (mesofilik); 45^oC (thermofilik)

d. Untuk penentuan mikroorganisme anaerob,inkubasi cawan-cawan tersebut dalam posisi terbalik dalam anaerobik jar dan masukkan ke dalam inkubator selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 22^oC ± 1^oC (psikrofilik); 35^oC(mesofilik); 45^oC (termofilik)

6.2 Metode cawan agar sebar / spread plate method 

a. Tuang 12ml - 15 ml PCA ke dalam cawan-cawan petri steril dan dinginkan. Pipet 0,1 ml dari setiap pengenceran (10^-1, 10^-2, dst) ke dalam cawan petri yang telah berisi media PCA diatas dan ratakan dengan menggunakan batang bengkok. Lakukan secara duplo untuk setiap pengenceran.

CATATAN : untuk pengujian bakteri termofilik, penambahan media PCA ke dalam cawan sebanyak 40 ml – 50 ml

b. Setelah contoh meresap ke dalam agar ( diamkan sekurang-kurangnya 1 jam) Untuk penentuan mikroorganisme aerob inkubasi cawan-cawan tersebut dalam posisi terbalik dalam inkubator selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 22^oC ± 1^oC (psikrofilik); 35^oC (mesofilik); 45^oC (termofilik). Untuk penentuan mikroorganisme anaerob, inkubasi cawan-cawan tersebut dalam posisi terbalik dalam anaerobik jar dan masukkan ke dalam inkubator selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 22^oC ± 1^oC (psikrofilik); 35^oC (mesofilik); 45^oC (termofilik)

c. Lakukan kontrol tanpa contoh dengan mencampur larutan pengencer dengan media PCA. 

7. Pembacaan dan perhitungan koloni pada cawan petri

7.1. Cawan yang mengandung jumlah 25 koloni – 250 koloni dan bebas spreader

Catat pengenceran yang digunakan dan hitung jumlah total koloni. Perhitungan Angka Lepeng Total sebagai berikut:

     

7.2. Cawan dengan jumlah koloni lebih besar dari 250

Bila jumlah koloni per cawan lebih besar dari 250 pada seluruh pengencer maka laporkan hasil sebagai terlalu banyak untuk dihitung ( TBUD), tetapi jika salah satu pengenceran mempunyai jumlah koloni mendekati 250 laporkan sebagai perkiraan ALT.

CONTOH:

Pengenceran   : 1:100 1:1000

Jumlah koloni  : TBUD 640

Perkiraan ALT koloni per ml atau per g : 640.000

7.3. Spreader

Koloni spreader dibedakan menjadi 3 tipe:

a. Rantai koloni, antara koloni saling menyambung yang disebabkan karena bakteri yang saling mengelompok

b. Spreader berasal dari lapisan air antara agar dan dasar cawan

c. Spreader berasal dari lapisan air pada sisi /pinggir cawan atau pada permukaaan agar

Jika cawan ditumbuhi spreader lebih besar dari 25 % maka laporkan sebagai sepreader.

- Spreader tipe 1, jika hanya ada 1 rantai maka nyatakan sebagai 1 koloni,

- Jika 1 atau lebih rantai terlihat berasal dari sumber yang berbeda, laporkan masing-masing sumber sebagai 1koloni

- Spreader tipe 2 dan 3 umumnya berasal dari koloni yang berbeda dan laporkan masing-masing sebagai 1 koloni

d.Jumlahkan spreader dan koloni untuk menghitung “ Angka Lempeng Total”

7.4. Jumlah koloni semua cawan kurang dari 25 koloni atau cawan tanpa koloni

Bila pada kedua pengenceran yang digunakan diperoleh koloni kurang dari 25, catat koloni yang ada, tetapi nyatakan perhitungan sebagai kurang dari 25 dan kalikan dengan 1/d, dimana d adalah faktor pengenceran pertama yang digunakan dan dilaporkan sebagai perkiraan ALT.

CONTOH :

Pengenceran : 1:100 1:1000

Jumlah koloni : 18 dan 0 2 dan 0

Perkiraan ALT koloni per ml atau koloni per g : lebih kecil dari 2.500 lebih kecil dari 2.500

8. Pelaporan

a. Untuk menghasilkan perhitungan yang akurat dan teliti, maka laporkan hasilnya dengan dua angka (digit) pertama sebagai hasil pembulatan.

b. Bulatkan keatas dengan cara menaikkan angka kedua menjadi angka yang lebih tinggi bila angka ketiga adalah 6, 7, 8 atau 9 dan gunakan angka 0 untuk masing-masing angka pada digit berikutnya.

c. Bulatkan ke bawah bila angka ketiga adalah 1, 2, 3 atau 4.  Bila angka ketiga 5, bulatkan keatas bila angka kedua ganjil dan bulatkan kebawah bila angka kedua itu genap.

CONTOH :

Hasil perhitungan ALT

12.700 13.000

12.400 12.000

14.500 16.000

14.501 14.000

d. Beri tanda bintang (*) untuk cawan yang kurang dari 25 koloni.

CONTOH :

Pengenceran : 1 : 100    1 : 1000

Jumlah Koloni : 18 dan 0    2 dan 0

Perkiraan ALT koloni per ml atau koloni per g : lebih kecil dari 2.500*   

e. Jika seluruh cawan berisi spreader atau cawan terkontaminasi oleh sesuatu yang tidak diketahui, maka laporkan hasil sebagai “ Kegagalan dalam pengujian “

Contoh perhitungan :

1. Cawan dengan jumlah koloni 25 –250

Perhitungan Angka lempeng Total sebagai berikut :

2. Seluruh cawan berisi spreader dan atau kegagalan dalam pengujian. Laporkan hasil sebagai “ Spreader “ ( SPR) atau kegagalan dalam pengujian

3.Seluruh cawan berisi lebih dari 100 koloni/cm2. Perkiraan jumlah angka lempeng total adalah lebih besar dari (>) 100 dikalikan pengenceran tertinggi dan dikalikan dengan luas cawan. Contoh dibawah  berdasarkan pada perhitungan rata-rata 110/cm2

CONTOH: Perkiraan ALT/ml (g)

Pengenceran    : 1 : 100 1:1000

Jumlah koloni  : tak terhingga 7.500^a lebih besar dari 6.500.000^b

 tak terhingga 6.490^c lebih besar dari 5.900.000

• a   Berdasarkan luas area 65 cm2

• b   Perkiraan jumlah ALT

• c   Berdasarkan luas area 59 cm2

Catatan : Untuk perhitungan koloni yang menggunakan metode cawan agar sebar/spread plate, jumlah koloni yang dihitung dikalikan dengan 10 dari pengenceran yang digunakan

9.  Keamanan dan keselamatan

Untuk menjaga keamanan dan keselamatan kerja selama melakukan analisa maka perlu diperhatikan hal-hal sebagai berikut :

a) cuci tangan sebelum dan sesudah melakukan analisa;

b) gunakan jas laboratorium selama melakukan analisa;

c) lakukan setiap tahapan analisa secara aseptis;

d) bersihkan meja kerja sebelum dan sesudah melakukan analisa;

e) bersihkan segera contoh yang tercecer dan mengandung bakteri dengan menggunakan bahan desinfectan;

f) media yang sudah digunakan disterilkan terlebih dahulu sebelum dibuang.

Reference: SNI. 01-2332.3 – 2006