Pengujian Coliform dan E. COLI

Metode ini digunakan untuk menentukan bakteri indikator sanitasi yaitu Coliform  dan  Escherichia coli atau yang bisa disebut E.Coli. 

Media dan Reagensia :

a.    Brilliant Green Lactose Bile Broth 2%(BGLB) 

b.    Lauryl Tryptose  Broth (LSB) 

c.    EC Broth 

d.    Levine’s Eosin Methylen Blue (L-EMB) Agar 

e.    Tryptone ( Trytophane ) Broth ( TB )  

f.     MR-VP Broth 

g.    Simmon Citrate Agar 

h.    Plate Count Agar  

i.      Larutan Butterfield’s Phosphate Buffered 

j.     Pereaksi Kovaks 

k.    Pereaksi Voges Preskauer 

l.      Indikator MR 

m.  Pereaksi pewarnaan gram

Peralatan

a.    Waterbath bertutup dengan sirkulasi 45 ^oC ± 0,5 ^oC ;

b.    Inkubator 35 ^oC ± 1 ^oC;

c.    Blender beserta jar yang dapat distrerilisasi atau stomacher ;

d.    Botol pengencer ;

e.    Tabung durham ;

f.     Cawan petri ukuran 15 mm X 90 mm;

g.    Tabung reaksi ukuran 16 mm x 150 mm dan 13 mm x 100mm;

h.    Timbangan dengan ketelitian 0,0001 g;

i.      mikroskop

j.     pipet atau pippetor 1 ml, 5 ml dan 10 ml.

Kondisi Pengujian Pengujian contoh kekerangan menggunakan 5 seri tabung pengencer sedangkan untuk produk perikanan lainnya menggunakan 3 seri tabung pengencer

Preparasi contoh Dengan menerapkan teknik aseptis, contoh diambil secara acak dan dipotong kecil-kecil hingga berat masing-masing contoh yang akan diuji sesuai ketentuan pada tabel dibawah. Contoh beku dilelehkan pada saat akan dianalisa dan pelelehan dilakukan selama 18 jam pada suhu sekitar 2^oC – 5^oC dan tidak lebih dari 15 menit.

Prosedur Pengujian

1. Persiapan contoh

• Untuk contoh dengan berat lebih kecil atau sama dengan 1 kg atau 1 l sampai dengan 4,5 kg atau 4,5 l timbang contoh padat sebanyak 25 g atau contoh cair sebanyak 25 ml dari contoh yang akan diuji, kemudian masukkan dalam wadah atau plastik steril dan tambahkan 225 ml larutan Butterfield’s phosphate Buffered
• Untuk contoh dengan berat lebih besar dari 4,5 kg atau 4,5 l timbang contoh padat sebanyak 50 g atau contoh cair sebanyak 50 ml, kemudian masukkan dalam wadah atau plastik steril dan tambahkan 450 ml larutan Butterfield’s phosphate Buffered
• Homogenkan selama 2 menit. Homogenat ini merupakan larutan dengan pengenceran 10^-1

2.           Tahap Analisa

·               Tahap Uji Pendugaan coliform  (Presumptive  coliform)

• Siapkan pengenceran 10^-2 dengan cara melarutkan larutan 10^-1 ke dalam 9 ml larutan pengencer Butterfield’s phosphate Buffered. Lakukan pengenceran selanjutnya sesuai dengan pendugaan kepadatan populasi contoh. Pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali.
• Pindahkan dengan menggunakan pipet steril, sebanyak 1 ml larutan dari setiap pengenceran ke dalam 3 seri atau 5 seri tabung lauryl tryptose broth ( LTB ) yang berisi tabung durham.
• Inkubasi tabung-tabung tersebut selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC. Perhatikan gas yang terbentuk setelah inkubasi 24 jam dan inkubasi kembali tabung-tabung negatif selama 24 jam. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan gas gas dalam tabung durham.
• Lakukan “ uji penegasan coliform” untuk tabung-tabung positif.

·                       Uji Penegasan  coliform ( Confirmed coliform )

• Inokulasi tabung-tabung LTB yang positif ke tabung-tabung BGLB Broth yang berisi tabung durham dengan menggunakan jarum ose. Inkubasi BGLB Broth yang telah diinokulasi selama 48 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC.
• Periksa tabung-tabung BGLB yang menghasilkan gas selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.
• Tentukan nilai paling memungkinkan ( APM ) berdasarkan jumlah tabung-tabung yang positif dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan ( APM ). Nyatakan nilainya sebagai “ APM/g coliform”

·                      Uji pendugaan Escherichia coli ( faecal coliform presumptive  Escherichia coli )

• Inokulasi dari setiap tabung LTB yang positif ke tabung-tabung EC broth yang berisi tabung durham dengan menggunakan jarum ose , Inkubasi EC broth  dalam  sirkulasi waterbath selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 45^oC ± 0,5^oC. Waterbath harus dalam keadaan bersih, air di dalamnya harus lebih tinggi dari tinggi cairan yang ada dalam tabung yang akan diinkubasi.
• Periksa tabung-tabung EC broth yang menghasilkan gas selama 24 jam ± 2 jam, jika negatif inkubasi kembali sampai 48 jam ± 2 jam. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.
•  Tentukan nilai angka paling memungkinkan ( APM ) berdasarkan jumlah tabung-tabung EC yang  positif dengan  menggunakan  Angka  Paling  Memungkinkan     ( APM ). Nyatakan nilainya sebagai “ APM/g faecal coliform “

·                      Uji penegasan Escherichia coli ( confirmed Escherichia coli )

• Dari tabung-tabung EC broth  yang positif dengan menggunakan jarum ose gores ke L-EMB agar. Inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC.
• Koloni Escherichia coli terduga memberikan ciri yang khas ( typical ) yaitu hitam pada bagian tengah dengan atau tanpa hijau metalik.
• Ambil lebih dari satu koloni ( typical ) Escherichia coli dari masing-masing cawan   L-EMB dan goreskan ke media PCA miring dengan menggunakan jarum tanam. Inkubasi selama  24 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC.
•  Jika koloni yang khas (typical) tidak ada, pindahkan 1 atau lebih koloni yang tidak khas ( typical ) Escherichia coli  ke media PCA miring.

                     Uji Morfologi

Lakukan uji morfologi dengan melakukan pewarnaan gram dari setiap koloni Escherichia coli  24 jam ± 2 jam dengan menggunakan mikroskop, bakteri  Escherichia coli   termasuk bakteri gram negatif, berbentuk batang pendek atau coccus.

                   Uji Biokimia

a.  Produksi Indol ( I )

Inokulasi 1 ose dari PCA miring ke dalam tryptone broth inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC. Uji indol dilakukan dengan menambahkan 0,2 ml – 0,3 ml pereaksi kovacs. Reaksi positif jika terbentuk cincin merah pada lapisan bagian atas media dan negatif bila terbentuk cincin warna kuning.

b.   Uji voges proskauer ( VP )

Inokulasi 1 ose dari PCA   miring ke dalam MRVP broth. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC. Pindahkan sebanyak 1 ml dari setiap MRVP broth yang tumbuh ke dalam tabung reaksi ukuran 13 mm X 100 mm steril dan tambahkan 0,6 ml larutan alpa naphtol dan 0,2 ml  40 % KOH. Kocok, tambahkan sedikit kristal kreatin untuk mempercepat reaksi. Kocok kembali dan diamkan selama 2 jam. Reaksi positif jika terbentuk warna merah muda eosin sampai merah mirah delima (ruby)

c. Uji methyl red ( MR )

Inkubasi kembali MRVP broth selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC. Tambahkan 5 tetes Methyl red pada setiap MRVP broth. Reaksi positif jika terbentuk warna merah dan negatif jika terbentuk warna kuning.

d. Uji Citrat (C)

Goreskan 1 ose dari PCA miring ke permukaan simmon citrat agar. Inkubasi selama 96 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC. Reaksi  positif jika terjadi pertumbuhan dan media berubah warna menjadi biru, reaksi negatif jika tidak ada pertumbuhan dan media tetap hijau.

e. Produksi gas dari laktosa

Inokulasi 1 ose dari PCA miring ke dalam LTB. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC reaksi positif jika menghasilkan gas pada tabung durham.

Pelaporan
Berdasarkan interpretasi hasil diatas, nyatakan coliform dan Escherichia coli  dalam APM/g dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan ( APM). Apabila pengujian menggunakan 3 seri tabung pengeceran gunakan tabel B1 lampiran B dan Apabila pengujian menggunakan 5 seri tabung pengenceran gunakan tabel C1 pada lapiran C

Keamanan dan Keselamatan Kerja ( K3 )
Untuk menjaga keamanan dan keselamatan kerja selama melakukan analisa maka perlu diperhatikan hal-hal sebagai berikut :

• Cuci tangan sebelum dan sesudah melakukan analisa
• Gunakan jas lab selama melakukan analisa
• Bersihkan meja kerja sebelum dan sesudah melakukan analisa
• Bersihkan segera contoh yang tercecer dan mengandung bakteri dengan menggunakan bahan desinfektan
• Media yang sudah digunakan disterilkan terlebih dahulu sebelum dibuang

Angka Paling Memingkinkan / APM dengan seri tabung pengenceran

A.1 Latar belakang

Metode untuk menduga jumlah bakteri dalam suatu produk, dapat menggunakan metode hitungan mikroskopis, metode hitungan cawan dan penentuan angka paling memungkinkan(APM). Organisme yang mati maupun hidup dapat dihitung dengan metode hitungan mikroskopis, akan tetapi pada APM hanya organisme hidup yang dapat dihitung.

Metode APM adalah metode untuk menghitung jumlah mikroba dengan menggunakan medium cair dalam tabung reaksi yang pada umumnya setiap pengenceran menggunakan 3 atau 5 seri tabung dan perhitungan yang dilakukan merupakan tahap pendekatan secara statistik. Tabung positif ditunjukan oleh adanya pertumbuhan bakteri dan gas. Nilai APM ini diperoleh dengan anggapan sebagai berikut: 

a.    Bakteri dalam contoh menyebar secara random

b.    Bakteri dalam contoh tidak berkelompok atau cluster, tetapi saling terpisah

c.    Organisme yang terdapat dalam contoh dapat tumbuh dalam medium selama inkubasi

d.    Kondisi yang sesuai untuk pertumbuhan, seperti media dan waktu inkubasi

Didalam penggunaan seri tabung pengenceran tingkat pengenceran yang diperlukan didasarkan pada pendugaan populasi bakteri yang ada dalam contoh. Hasil yang baik adalah jika pada pengenceran yang lebih rendah contoh yang diduga lebih banyak menunjukkan hasil uji positif ( adanya pertumbuhan bakteri) dan pada pengenceran lebih tinggi contoh yang diduga lebih sedikit menunjukkan hasil uji negatif (tidak ada pertumbuhan bakteri). Oleh karena itu jumlah populasi bakteri yang ada dalam contoh diduga tinggi maka contoh harus diencerkan sampai diperoleh tingkat pengeceran yang lebih tinggi sehingga nilai APM maksimum yang dapat dihitung. Metode pengenceran yang paling mudah adalah dengan melakukan pengeceran 10 kali lipat dengan menggunakan 3 atau 5 seri tabung pengenceran.

Metode APM digunakan untuk menduga organisme dalam jumlah sedikit (kurang dari 100/g) terutama susu, air dan makanan yang mempunyai partikel-partikel lain yang mungkin mengganggu keakurasian perhitungan. Kombinasi tabung-tabung positif yang diperoleh cukup untuk memberikan hasil yang signifikan dan umumnya terdapat dalam tabel APM, sedangkan kombinasi yang tidak mungkin diabaikan. Tabel APM mempunyai tingkat kepercayaan 95 %. Jika kombinasi tabung-tabung positif yang diperoleh tidak termasuk dalam tabel APM maka contoh yang asli harus dilakukan pengujian kembali. Dan jika ini tidak dapat dilakukan, maka analis harus membandingkan dengan tabel APM yang lain untuk menghitung nilai APM berdasarkan hasil yang diperoleh.

A.2 Cara pemilihan kombinasi tabung positif pada 3 dan 5 seri tabung pengenceran dalam tabel APM

Penentuan APM dihitung berdasarkan jumlah seri tabung positif pada beberapa pengenceran yang digunakan yang didasarkan pada 3 atau 5 seri tabung pengenceran yang digunakan. Kombinasi yang diambil adalah 3 tingkat pengenceran dengan kaidah sebagai berikut :

Kasus 1 seluruh tabung pada seri tabung pengenceran ( 10^-1 , 10^-2 , dst ) menunjukkan reaksi positifpilih tingkat pengenceran tertinggi yang menghasilkan seluruh tabung positif dan 2 pengenceran berikutnya seperti contoh a dan a ( tabel A).

• Jika pada tingkat pengenceran yang paling tinggi masih menghasilkan tabung positif (tingkat pengenceran 10^-3 menghasilkan 1 tabung positif) maka tingkat pengenceran tersebut tingkat pengenceran tertinggi yang dipilih, seperti pada contoh c (Tabel A).
• Jika pada tingkat pengenceran tertentu menghasilkan tabung negatif (tingkat pengenceran 10^-3) tetapi pengenceran berikutnya menghasilkan tabung positif (tingkat pengenceran 10^-4 menghasilkan 1 tabung positif ) maka yang dinyatakan tabung positif adalah tingkat pengenceran sebelumnya seperti pada contoh d ( Tabel A).
• Jika pada tingkat pengeceran tertinggi (10^-4) masih terdapat tabung positif, maka pilih tingkat pengenceran sebelumnya seperti pada contoh e (Tabel A). 

Kasus 2 Tidak ada satupun dari seri pengenceran yang menghasilkan seluruh tabung positif

a.    Lihat pada contoh f (tabel A), jika tingkat pengenceran tertentu menghasilkan tabung positif (10^-2) maka pilih 2 tingkat pengenceran sebelumnya

b.  Jika pada pengenceran yang lebih tinggi masih menghasilkan tabung positif ( pengenceran 10^-3 menghasilkan 1 tabung positif ) maka tambahkan tabung positif tersebut ke tingkat pengenceran sebelumnya seperti pada Tabel A (Contoh g).

Acuan:  SNI. 01-2332.1 -2006

PENGUJIAN ORGANOLEPTIK/SENSORI

Ruang Lingkup: Pengujian organoleptik merupakan petunjuk untuk menetapkan persyaratan dalam  melakukan pengujian organoleptik / sensory

Prinsip pengujian Organoleptik/Sensori: Pelaksanaan uji organoleptik/sensori menggunakan indera manusia sebagai alat utama untuk menilai mutu produk perikanan.

Istilah dan definisi yang digunakan dalam pengujian organoleptik/sensori adalah sebagai berikut:

1. Konsistensi : suatu sifat produk yang memperhatikan karakteristik aslinya berbentuk cairan dan semi padat
2. Lembar penilaian (scrore sheet) : alat bantu untuk membimbing panelis dalam menilai mutu suatu produk melalui spesifikasi yang menguraikan tingkatan mutu berdasarkan nilai.
3. Panelis : orang yang bertugas menilai spesifikasi mutu produk secara subjektif
4. Penelis non standar: orang yang belum terlatih dalam melakukan penilaian dan pengujian organoleptik / sensori
5. Panelis standar : orang yang mempunyai kemampuan dan kepekaan tinggi terhadap spesifikasi mutu produk serta mempunyai pengetahuan dan pengalaman tentang cara-cara menilai organoleptik/ sensori dan lulus dalam seleksi pembentukan panelis standar.
6. Pengujian organoleptik : pengujian organoleptik merupakan cara pengujian menggunakan indra manusia sebagai alat utama untuk menilai mutu ikan hidup dan produk perikanan yang segar utuh.
7. Pengujian sensori : Pengujian sensori merupakan cara pengujian menggunakan indera manusia sebagai alat utama untuk melihat mutu produk perikanan yang sudah mengalami proses pengolahan
8. Produk perikanan : ikan termasuk biota perairan lainnya yang ditangani dan /atau diolah untuk dijadikan produk akhir yang berupa ikan segar, ikan beku dan olahan lainnya yang digunakan untuk konsumsi manusia
9. Tekstur : suatu sifat karakteristik kelenturan dari produk yang berbentuk padat
10. Uji deskripsi (descriptive test) : metode uji yang digunakan untuk mengindentifikasi spesifikasi organoleptik / sensori suatu produk dalam bentuk uraian pada lembar penilaian
11. Uji hedonik (hedonic test) : metode uji yang digunakan untuk mengukur tingkat kesukaan terhadap produk dengan menggunakan lembar penilaian
12. Uji skor (scoring test) : metode uji dalam menentukan tingkatan mutu berdasarkan skala angka 1 (satu) sebagai nilai terendah dan angka 9 (sembilan) sebagai nilai tertinggi dengan menggunakan lembar penilaian

Peralatan – Peralatan yang dibutuhkan dalam melakukan pengujian Organoleptik/sensori adalah:

1. Peralatan preparasi contoh

• Alat memasak;

• Kotak berinsulasi;

• Exhauster;

• Timbangan dengan ketelitian 0,1 g;

• Wadah bertutup;

• Refrigerator;

• Freezer.

2. Peralatan pengujian:

- Meja dan kursi pengujian;

- Wastafel dan kran air yang dilengkapi dengan lap tangan dan sabun pembersih yang tidak berbau;

- Tisue polos berwarna putih dan tidak berbau;

- Gelas;

- Garpu dan sendok stainless steel;

- Piring;

- Wadah;

- Pisau;

- Talenan.

Catatan : peralatan pengujian organoleptik/ sensori tidak bermotif dan berwarna netral.

Adapun Persyaratan pelaksanaan uji organoleptik/sensori

1. Kondisi Pengujian

* Ruangan

• Laboratorium pengujian organoleptik/sensori terletak dilokasi yang tenang dan bebas dari pencemaran yang dapat menganggu panelis
• Laboratorium pengujian organoleptik/sensori terbagi atas 2 bagian, yaitu ruang pengujian yang terdiri dari bilik pencicip dan ruang dapur pengujian yang mempunyai saluran pembuangan yang memenuhi syarat sanitasi dan hygiene
• Bilik pencicip dibuat bersekat-sekat untuk mencegah hubungan antar panelis baik secara langsung maupun tidak langsung.  Bilik pencicip berukuran panjang 60 cm- 80 cm, lebar 45cm-55 cm dan tinggi sekat + 75 cm dengan tinggi meja dari lantai + 75 cm.  Laboratorium organoleptik/sensori minimal mempunyai 6 buah bilik pencicip untuk 6 orang panelis.
• Meja pengujian terbuat dari bahan yang keras, tahan panas dan permukaannya mudah dibersihkan
• Dinding dan lantai berwarna netral, tidak berbau, tidak memantulkan cahaya dan mudah dibersihkan
• Ruangan pengujian dilengkapi dengan alat pengatur suhu ruangan, alat pengukur suhu dan kelembaban.  Suhu ruangan 20oC – 25oC.  Kelembaban 40 %- 60%.
• Penerangan harus menyebar rata ke segala arah dengan intensitas cahaya 70 footcandles – 80 footcandles (fc) serta tidak mempengaruhi kenampakan produk yang diuji.  Jika penilaian lebih difokuskan terhadap kenampakan produk maka digunakan intensitas cahaya lebih dari 100 Foot Candle .

* Waktu Pengujian

Pelaksanaan uji organoleptik/sensori dilakukan pada saat panelis tidak dalam kondisi lapar atau kenyang, yaitu sekitar pukul 09.00 – 11.00 WIB dan pukul 14.00 – 16.00 WIB atau sesuai kebiasaan waktu setempat.

Jumlah panelis minimal panelis standar dalam satu kali pengujian adalah 6 orang, sedangkan untuk panelis non standar adalah 30 orang, dengan Syarat-syarat panelis adalah sebagai berikut :

• Tertarik terhadap uji organoleptik sensori dan mau berpartisipasi;
• Konsisten dalam mengambil keputusan;
• Berbadan sehat, bebas dari penyakit THT, tidak buta warna serta gangguan psikologis;
• Tidak menolak terhadap makanan yang akan diuji ( tidak alergi);
• Tidak melakukan uji 1 jam sesudah makan;
• Menunggu niminal 20 menit setelah merokok, makan permen karet, makan dan minuman ringan;
• Tidak melakukan uji pada saat sakit influenza dan sakit mata;
• Tidak memakan makanan yang sangat pedas pada saat makan siang, jika pengujian dilakukan pada waktu siang hari;
• Tidak menggunakan kosmetik seperti parfum dan lipstik serta mencuci tangan dengan sabun yang tidak berbau pada saat dilakukan uji bau.

Catatan: disarankan mencuci mulut dengan air putih pada saat melakukan uji rasa.

Penyajian contoh

Beberapa hal yang perlu diperhatikan sebelum penyajian contoh, yaitu:

• Produk olahan yang perlu dimasak dapat dilakukan dengan cara perebusan, pengukusan, penggorengan dan pemanggangan. Pengukusan dilakukan pada suhu 100 oC dengan membungkus produk dalam alumunium foil: penggorengan dilakukan pada suhu 140 oC dengan menggoreng produk dalam minyak goreng non curah. Waktu pemasakan sangat bervariasi sesuai dengan ukuran, jenis produk dan peralatan yang digunakan. Pemasakan produk untuk uji rasa tidak boleh mempengaruhi rasa khas produk.
• Pelelehan terhadap produk beku dilakukan dengan menghindarkan kontak langsung dengan air, misal membungkus produk dalam plastik/alumunium foil.
• Penyajian contoh mewakili produkyang akan diuji baik bentuk maupun ukuran. Jumlah minimal contoh cairan 16 ml dan padatan 28 gram.
• Penyajian contoh dalam wadah yang sama baik ukuran, bentuk maupun bahan
• Pengujian contoh yang diuji pada suhu tertentu disiapkan sedemikian rupa sehingga suhu produk yang diinginkan tidak berubah pada saat pengujian berlangsung
• Pengkodean terhadap contoh yang disajikan menggunakan angka untuk menghilangkan dugaan oleh panelis terhadap mutu produk yang akan diuji. Angka yang digunakan terdiri dari lima digit dan diambil secara acak.

Cara Penilaian contoh

Contoh yang telah siap diuji disajikan dalam bilik-bilik pencicipan. Uji rasa dilengkapi dengan air sirup, air putih, tisu, dan peralatan lain yang berhubungan dengan jenis contoh.

1. Uji deskripsi: Penilaian contoh yang diuji dideskripsikan dalam lembar penilaian meliputi spesifikasi kenampakan, bau, rasa, tekstur/konsistensi, dan spesifikasi lainnya yang erat hubungannya dengan kondisi contoh
2. Uji hedonik: Penilaian contoh yang diuji berdasarkan tingkat kesukaan panelis. Jumlah tingkat kesukaan bervariasi tergantung dari rentangan mutu yang ditentukan. Penilaian dapat diubah dalam bentuk angka dan selanjutnya dapat dianalisis secara statistik untuk penarikan kesimpulan.
3. Uji Skor: Penilaian contoh yang diuji dilakukan dengan cara memberikan nilai pada lembar penilaian sesuai dengan tingkatan mutu produk.

Kesimpulan uji deskripsi

Hasil  uji deskripsi masing-masing panelis pada lembar penilaian dikompilasi dan dianalisis menjadi suatu kesimpulan yang menyatakan spesifikasi kenampakan, bau, rasa, konsistensi/tekstur, dan spesifikasi lain

Perhitungan

Uji hedonik: Data yang diperolah dari lembar penilaian ditabulasi dan ditentukan nilai mutunya dengan mencari hasil rata-rata pada setiap panelis pada tingkat kepercayaan 95 %. Untuk menghitung interval nilai mutu rata-rata dari setiap panelis digunakan rumus sebagai berikut :

Uji skor: Data yang diperoleh dari lembar penilaian ditabulasi dan ditentukan nilai mutunya dengan mencara hasil rerata pada setiap panelis pada tingkat kepercayaan 95 %. Untuk menghitung interval nulai mutu rerata dari setiap panelis digunakan rumus sebagai berikut:

PELAPORAN

• Laporkan hasil uji deskripsi dalam bentuk uraian spesifikasi dari produk yang diuji.
• Laporkan hasil uji hedonik dalam bentuk 1 angka dibelakang koma dan dikonversi ke tingkat kesukaan. Jika angka dibelakang koma kurang dari lima maka angka di depan koma tetap, tetapi apabila angka di belakang koma lebih dari lima maka angka didepan koma naik satu angka. Jika di belakang koma lima maka nilai tetap. Contoh :

6,4 dibulatkan menjadi 6,0

6,6 dibulatkan menjadi 7,0

6,5 tetap 6,5

• Laporkan hasil uji skor dalam bentuk 1 angka dibelakang koma dan dikonversi ke tingkat kesukaan. Jika angka dibelakang koma kurang dari lima maka angka di depan koma tetap, tetapi apabila angka di belakang koma lebih dari lima maka angka didepan koma naik satu angka. Jika di belakang koma lima maka nilai tetap. Contoh :

6,4 dibulatkan menjadi 6,0

6,6 dibulatkan menjadi 7,0

6,5 tetap 6,5

Keamanan dan keselamatan kerja [K3]

Untuk menjaga keamanan dan keselamatan kerja selama melakukan pengujian organoleptik/sensori maka perlu diperhatikan hal-hal sebagai berikut:

• Menggunakan jas laboratorium saat melakukan pengujian
• Pada saat penyajikan contoh gunakan tutup kepala, masker, sarung tangan dan alat bantu untuk menghindari kontak langsung dengan produk
• Gunakan alat bantu jangan menyentuh produk dengan tangan terbuka (gunakan alat bantu)

Acuan : SNI 01-2346-2011

METODE PENENTUAN ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT)

1. Tujuan :  

    Metode penentuan angka lempeng total ini, digunakan untuk menentukan jumlah total mikroorganisme aerob dan anaerob ( psikrofilik, mesofilik dan termofilik).

2. Media dan Reagensia :

a. Plate Count Agar (SNI : M.53)

b. Larutan Butterfield’sphosphate Buffered (SNI : R.3)

c. Gas pack dan indikator air anaerob

3. Peralatan

a. Timbangan dengan ketelitian 0,0001 g

b. Autoclave

c. Inkubator 35 ± 1^o C 

d. Anaerobic jar

e. Cawan Petri 15 mm x 90 mm

f. Botol Pengencer 

g. Alat penghitung koloni

h. Blender beserta Jar yang dapat disterilisasi atau stomacher

i. Batang gelas bengkok diameter 3 mm-4mm,dengan panjang tangkai 15cm-20cm

j. Pipet gelas atau pipetor : 0,1 ml, 1 ml, 5 ml dan 10 ml

4. Kondisi

Pada metode cawan agar tuang, untuk menghindari berkurangnya populasi bakteri akibat panas yang berlebih maka media agar yang akan dituang mempunyai suhu 45^oC ± 1^o C

5. Preparasi contoh

5.1. Berat contoh yang akan diuji diambil dengan ketentuan sebagai berikut :

a.  Contoh dengan berat lebih kecil dari 1 kg

Dengan menerapkan teknik aseptis, ambil contoh secara acak dengan potong kecil-kecil hingga beratnya mencapai 100 g

b. Contoh dengan berat 1 –  4,5 kg

Dengan menerapkan teknik aseptis, ambil contoh secara acak dan potong kecil-kecil hingga beratnya mencapai 300 g

c. Contoh dengan berat lebih besar dari 4,5 kg

Dengan menerapkan teknik aseptis, ambil contoh secara acak dan potong kecil-kecil hingga beratnya mencapai 500 g

5.2. Timbang contoh secara aseptis sebanyak 25 gram untuk contoh dengan ketentuan a dan b dan 50 g untuk contoh  dengan ketentuan c diatas, kemudian masukkan dalam wadah atau plastik steril. Untuk contoh 25 g tambahkan 22 ml larutan  butterfield’sphosphate buffered dan untuk contoh 50 g tambahkan 450 ml larutan butterfield’sphosphate buffered homogenkan selama 2 menit. Homogenat ini merupakan larutan pengenceran 10^-1. Dengan menggunkan pipit steril, ambil 1 ml homogenat diatas dan masukkan ke dalam 9 ml larutan butterfield’sphosphate buffered untuk mendapatkan pengenceran 10^-2. Siapkan pengenceran selanjutnya (10^-3) dengan mengambil 1 ml contoh pengenceran 10^-2  ke dalam 9 ml larutan butterfield’sphosphate buffered. Pada setian pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali. Selanjutnya lakukan hal yang sama untuk pengeceran 10^-4, 10^-5 dst sesuai kondisi contoh

6. Prosedur 

6.1. Metode cawan agar tuang / pour plate method

a. Pipet 1 ml dari setiap pengenceran 10^-1, 10^-2, dst dan masukkan ke dalam cawan petri steril. Lakukan secara duplo untuk setiap pengenceran

b. Tambahkan 12 ml –15 ml PCA tuang sudah didinginkan dalam waterbath hingga mencapai suhu 45^oC ± 1^oC ke dalam masing-masing cawan yang sudah berisi contoh. Supaya contoh dan media PCA tercampur sempurna lakukan pemutaran cawan ke depan ke belakang dan ke kiri – ke kanan

CATATAN : untuk pengujian bakteri termofilik, penambahan media PCA ke dalam cawan sebanyak 40 ml – 50 ml

c. Setelah  agar menjadi padat, untuk penentuan mikroorganisme aerob inkubasi cawan-cawan tersebut dalam posisi terbalik dalam inkubator selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 22^oC ± 1oC (psikrofilik); 35^oC (mesofilik); 45^oC (thermofilik)

d. Untuk penentuan mikroorganisme anaerob,inkubasi cawan-cawan tersebut dalam posisi terbalik dalam anaerobik jar dan masukkan ke dalam inkubator selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 22^oC ± 1^oC (psikrofilik); 35^oC(mesofilik); 45^oC (termofilik)

6.2 Metode cawan agar sebar / spread plate method 

a. Tuang 12ml - 15 ml PCA ke dalam cawan-cawan petri steril dan dinginkan. Pipet 0,1 ml dari setiap pengenceran (10^-1, 10^-2, dst) ke dalam cawan petri yang telah berisi media PCA diatas dan ratakan dengan menggunakan batang bengkok. Lakukan secara duplo untuk setiap pengenceran.

CATATAN : untuk pengujian bakteri termofilik, penambahan media PCA ke dalam cawan sebanyak 40 ml – 50 ml

b. Setelah contoh meresap ke dalam agar ( diamkan sekurang-kurangnya 1 jam) Untuk penentuan mikroorganisme aerob inkubasi cawan-cawan tersebut dalam posisi terbalik dalam inkubator selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 22^oC ± 1^oC (psikrofilik); 35^oC (mesofilik); 45^oC (termofilik). Untuk penentuan mikroorganisme anaerob, inkubasi cawan-cawan tersebut dalam posisi terbalik dalam anaerobik jar dan masukkan ke dalam inkubator selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 22^oC ± 1^oC (psikrofilik); 35^oC (mesofilik); 45^oC (termofilik)

c. Lakukan kontrol tanpa contoh dengan mencampur larutan pengencer dengan media PCA. 

7. Pembacaan dan perhitungan koloni pada cawan petri

7.1. Cawan yang mengandung jumlah 25 koloni – 250 koloni dan bebas spreader

Catat pengenceran yang digunakan dan hitung jumlah total koloni. Perhitungan Angka Lepeng Total sebagai berikut:

     

7.2. Cawan dengan jumlah koloni lebih besar dari 250

Bila jumlah koloni per cawan lebih besar dari 250 pada seluruh pengencer maka laporkan hasil sebagai terlalu banyak untuk dihitung ( TBUD), tetapi jika salah satu pengenceran mempunyai jumlah koloni mendekati 250 laporkan sebagai perkiraan ALT.

CONTOH:

Pengenceran   : 1:100 1:1000

Jumlah koloni  : TBUD 640

Perkiraan ALT koloni per ml atau per g : 640.000

7.3. Spreader

Koloni spreader dibedakan menjadi 3 tipe:

a. Rantai koloni, antara koloni saling menyambung yang disebabkan karena bakteri yang saling mengelompok

b. Spreader berasal dari lapisan air antara agar dan dasar cawan

c. Spreader berasal dari lapisan air pada sisi /pinggir cawan atau pada permukaaan agar

Jika cawan ditumbuhi spreader lebih besar dari 25 % maka laporkan sebagai sepreader.

- Spreader tipe 1, jika hanya ada 1 rantai maka nyatakan sebagai 1 koloni,

- Jika 1 atau lebih rantai terlihat berasal dari sumber yang berbeda, laporkan masing-masing sumber sebagai 1koloni

- Spreader tipe 2 dan 3 umumnya berasal dari koloni yang berbeda dan laporkan masing-masing sebagai 1 koloni

d.Jumlahkan spreader dan koloni untuk menghitung “ Angka Lempeng Total”

7.4. Jumlah koloni semua cawan kurang dari 25 koloni atau cawan tanpa koloni

Bila pada kedua pengenceran yang digunakan diperoleh koloni kurang dari 25, catat koloni yang ada, tetapi nyatakan perhitungan sebagai kurang dari 25 dan kalikan dengan 1/d, dimana d adalah faktor pengenceran pertama yang digunakan dan dilaporkan sebagai perkiraan ALT.

CONTOH :

Pengenceran : 1:100 1:1000

Jumlah koloni : 18 dan 0 2 dan 0

Perkiraan ALT koloni per ml atau koloni per g : lebih kecil dari 2.500 lebih kecil dari 2.500

8. Pelaporan

a. Untuk menghasilkan perhitungan yang akurat dan teliti, maka laporkan hasilnya dengan dua angka (digit) pertama sebagai hasil pembulatan.

b. Bulatkan keatas dengan cara menaikkan angka kedua menjadi angka yang lebih tinggi bila angka ketiga adalah 6, 7, 8 atau 9 dan gunakan angka 0 untuk masing-masing angka pada digit berikutnya.

c. Bulatkan ke bawah bila angka ketiga adalah 1, 2, 3 atau 4.  Bila angka ketiga 5, bulatkan keatas bila angka kedua ganjil dan bulatkan kebawah bila angka kedua itu genap.

CONTOH :

Hasil perhitungan ALT

12.700 13.000

12.400 12.000

14.500 16.000

14.501 14.000

d. Beri tanda bintang (*) untuk cawan yang kurang dari 25 koloni.

CONTOH :

Pengenceran : 1 : 100    1 : 1000

Jumlah Koloni : 18 dan 0    2 dan 0

Perkiraan ALT koloni per ml atau koloni per g : lebih kecil dari 2.500*   

e. Jika seluruh cawan berisi spreader atau cawan terkontaminasi oleh sesuatu yang tidak diketahui, maka laporkan hasil sebagai “ Kegagalan dalam pengujian “

Contoh perhitungan :

1. Cawan dengan jumlah koloni 25 –250

Perhitungan Angka lempeng Total sebagai berikut :

2. Seluruh cawan berisi spreader dan atau kegagalan dalam pengujian. Laporkan hasil sebagai “ Spreader “ ( SPR) atau kegagalan dalam pengujian

3.Seluruh cawan berisi lebih dari 100 koloni/cm2. Perkiraan jumlah angka lempeng total adalah lebih besar dari (>) 100 dikalikan pengenceran tertinggi dan dikalikan dengan luas cawan. Contoh dibawah  berdasarkan pada perhitungan rata-rata 110/cm2

CONTOH: Perkiraan ALT/ml (g)

Pengenceran    : 1 : 100 1:1000

Jumlah koloni  : tak terhingga 7.500^a lebih besar dari 6.500.000^b

 tak terhingga 6.490^c lebih besar dari 5.900.000

• a   Berdasarkan luas area 65 cm2

• b   Perkiraan jumlah ALT

• c   Berdasarkan luas area 59 cm2

Catatan : Untuk perhitungan koloni yang menggunakan metode cawan agar sebar/spread plate, jumlah koloni yang dihitung dikalikan dengan 10 dari pengenceran yang digunakan

9.  Keamanan dan keselamatan

Untuk menjaga keamanan dan keselamatan kerja selama melakukan analisa maka perlu diperhatikan hal-hal sebagai berikut :

a) cuci tangan sebelum dan sesudah melakukan analisa;

b) gunakan jas laboratorium selama melakukan analisa;

c) lakukan setiap tahapan analisa secara aseptis;

d) bersihkan meja kerja sebelum dan sesudah melakukan analisa;

e) bersihkan segera contoh yang tercecer dan mengandung bakteri dengan menggunakan bahan desinfectan;

f) media yang sudah digunakan disterilkan terlebih dahulu sebelum dibuang.

Reference: SNI. 01-2332.3 – 2006