Metode pengujian kadar Histamin ini Dapat
diterapkan pada jenis-jenis ikan yang tergolong dalam Scromboidea, yang
terdapat dalam ikan-ikan Tuna, Bonito, Kingfish, dan Mackerel serta ikan Mahi-mahi
(dolphin)
Prinsip : Histamin diekstrak dari jaringan daging
contoh menggunakan methanol dan sekaligus mengkonversi histamine ke dalam
bentuk OH. Zat – zat histamine
selanjutnya dimurnikan melalui resin penukar ion dan diubah ke bentuk
derivatnya dengan senyawa OPT. Besarnya
fluorosensi histamine diukur secra flurometri pada panjang gelombang eksitasi
350 nm dan emisi 444 nm
Peralatan :
a.
Corong dan
botol filtrate contoh;
b.
Homogenizer
(blender);
c.
Kertas
saring kasar, plastic, karet pengikat;
d.
Kolom resin
20 cm X 0,8 cm, reservoir 2 cm X 5 cm;
e.
Labu Takar
25 ml, 50 ml, 100 ml dan 1.000 ml;
f.
Pipet
volumetric;
g.
Spektroflurometer;
h.
Stirer-plate;
i.
Tabung
reaksi 50 ml bertutup;
j.
Timbangan
analitis;
k.
Waterbath.
 |
| Alat Spectrolorometri, Perkin Elemer LS 45 |
 |
| Kolom untuk tahap elusi |
Pereaksi :
a.
Metanol;
b.
Aquades;
c.
Glasswool;
d.
NaOH 1 N: Larutkan
4 g NaOH dalam 100 ml Aquades
e.
HCl 0,1 N: Encerkan
8 ml HCl 12,5 N (37 %) dalam 1.000 ml Aquades
f. Orto-ptalatdikarboksildehid
(OPT) 0,1 % : Larutkan 0,1 g OPT dalam 100 ml methanol, larutan ini disiapkan
pada kondisi segar dalam setiap analisa
g. Asam
Phosphat (H3PO4) 3,57 N: Encerkan 121,8 ml H3PO4
(85%) menjadi 1.000 ml aquades, standarkan larutan ini dengan mengambil 5 ml
dan titrasi dengan NaOH 1 N dengan indicator fenolftalin)
h.
Resin
penukar ion jenis Dowex 1 – X8 50 – 100 mesh
i.
Pembuatan
larutan standar histamine
· Larutan stok
1 mg/ml (1.000 ppm)
Timbang teliti 169,1 mg
Histamin 2 HCl, larutkan dan tepatkan menggunakan HCl 0,1 N dalam labu takar
100 ml sampai batas volume. Siapkan
larutan ini dalam kondisi segar setiap minggu dan disimpan dalam refrigerator
·
Larutan
stock 10 µl/ml (10
ppm)
Pipet 1 ml larutkan stock
(1.000 ppm) masukkan ke dalam labu takar 100 ml dan tambahkan larutan HCl 0,1 sampai batas
volume. Siapkan larutan ini dalam
kondisi segar setiap minggu dan disimpan dalam refrigerator
j.
Larutan
kerja
Buat larutan
kerja 0,1 µg/ml (0,1
ppm); 0,2 µg/ml (0,2
ppm); 0,3 µg/ml (0,3
ppm).
Siapkan
larutan kerja ini setiap hari (setiap akan digunakan). Apabila larutan kerja tersebut menghasilkan
fluorosensinya yang maksimal pada pembacaan dengan instrument, maka larutan
kerja tersebut dapat diencerkan sesuai dengan keperluan
Prosedur
Analisis:
1. Preparasi contoh
a. Blender contoh hingga
homogen
b. Timbang seksama lebih kurang 10 g contoh dalam beaker glass 250
ml dan tambahkan 50 ml methanol, blender hingga homogen
c. Panaskan diatas waterbath selama 15 menit pada suhu 60 oC
dijaga sample dalam kondisi tertutup, dinginkan hingga suhu kamar
d. Tuangkan contoh ke dalam labi takar 100 ml dan tepatkan hingga
volume labu dengan methanol
e. Saring menggunakan kertas saring dan filtratnya ditampung dalam
botol contoh. Pada tahap ini filtrate contoh dapat disimpan dalam refrigerator
2. Persiapan Resin
a)
Timbang 3
gram resin untuk setiap kolom dalam beaker glass 250 ml
b)
Tambahkan 15
ml NaOH 2 N/g resin untuk mengubah resin menjadi bentuk OH
c)
Aduk
menggunkan stirrer- plate selama 30 menit
d)
Tuang cairan
pada bagian atas dan ulangi penambahan NaOH 2 N dengan jumlah yang sama
e)
Cuci/bilas
resin dengan aquades sebanyak 3 kali
f)
Saring
melalui kertas saring No. 588 atau yang setara dan cuci kembali aquades
g)
Siapkan
resin setiap minggu dan simpan dalam aquades
3. Persiapan Kolom Resin
a)
Masukkan
glasswool ke dalam kolom resin setinggi ± 1,5 cm
b)
Masukkan
resin dalam medium air ke kolom resin setinggi ± 8 cm, pertahankan volume air
yang berada di atas resin ±
1 cm, jangan dibiarkan kering.
c)
Letakkan
labu takar 50 ml yang sudah berisi 5 ml HCl 1 N di bawah kolom resin guna
menampung elusi contoh yang dilewatkan pada kolom resin. Diperlihatkan dalam gambar di bawah ini
4. Pemurnian Contoh
a)
Pipet 1 ml
Filtrat contoh, masukkan dalam kolom resin, kran kolom resin dalam posisi
terbuka biarkan aliran menetes (hasil elusi) ditampung dalam labu takar 50 ml
b) Tambahkan aquades pada saat
tinggi cairan ± 1 cm di
atas resin dan biarkan cairan terelusi. Lakukan seterusnya hingga hasil elusi
dalam labu takar tepat 50 ml. Hasil
elusi (contoh) dapat disimpan dalam refrigerator.
5. Pembentukan Senyawa Turunan (derivatisasi)
Siapkan tabung reaksi 50 ml
masing-masing untuk contoh, standard an blanko
a)
Pipet
masing-masing 5 ml filtrate contoh, larutan standar kerja dan blanko (HCl 0.1
N)
b)
Tambahkan ke
dalam tabung reaksi di atas berturut-turut;
· 10 ml HCl
0,1 N kocok
· 3 ml NaOH 1
N, kocok, dalam waktu 5 menit harus sudah ditambah 1 ml OPT 0,1%, kocok dan
biarkan selama $ menit
· 3 ml H3PO4
3,57 N kocok
c)
Lakukan
pengukuran fluorosence terhadap contoh, standar dan blanko sesegera mungkin
dengan alat spectrofluorometer pada panjang gelombang exsitasi: 350 nm dan
emisi: 444 nm dalam jangka waktu 90 menit.
Perhitungan
- Masukkan
harga konsentrasi dan fluoresensi dari larutan standar kerja ke dalam program
linier kalkulator. Nilai: koefisien
regresi ( R ), slope (b) dari intersep (a) digunakan untuk menghitung
konsentrasi contoh. Masukkan harga
fluoresence contoh ke persamaan regresi standar:
- 2. Setelah didapat harga x , kalikan dengan faktor pengenceran dan kembalikan ke berat contoh. Nyatakan kandungan histamin dalam (µg/g) atau mg / kg contoh.
Pelaporan
a. Jika angka desimal kurang dari 5
(lima) maka pembulatan ke bawah, tetapi bila lebih dari 5 (lima) pembulatan ke
atas.Contoh :
14,454 dibulatkan menjadi 14,76
14,466 dibulatkan menjadi 14,47
b. Jika angka ke tiga di belakang
koma 5 (lima), dan angka kedua genap, maka angka lima tersebut menjadi hilang tapi
bila angka kedua ganjil maka pembulatan ke atas. Contoh :
14,765 dibulatkan menjadi 14,76
14,475 dibulatkan menjadi 14,48
Keamanan dan
Keselamatan Kerja
Untuk menjaga keamanan dan keselamatan kerja
selama melakukan analisa maka perlu diperhatikan hal-hal sebagai berikut :
a.
Cuci tangan sebelum dan sesudah melakukan
analisa.
b.
Gunakan jas laboratorium selama bekerja.
Acuan : SNI – 01 – 2354.10
: 2009
